大家好，我是山东东达聚合物有限公司的技术员小王，今天来给大家详细的介绍一下聚丙烯酰胺凝胶配方：
聚丙烯酰胺凝胶配方，丙烯酰胺有效分离（bp)二甲苯青溴酚蓝丙烯酰胺30%（ml）10×TBE（ml)ddH2O（ml） TEMED（µl） 过硫酸铵10%（µl）
3.5%100-10004601005.83539.1725.0250
5.0%100-500260658.33536.6725.0250
8.0%60-4001604513.33531.6725.0250
12.0%40-200702020.0525.0025.0250
15.0%25-150601525.0520.0025.0250
20.0%5-100451233.33511.6725.0250
5ml体系：
丙烯酰胺丙烯酰胺30%
（ml）10×TBE
（ml） ddH2O
（µl） TEMED
（µl）过硫酸铵10%
（µl）
3.5%0.5830.53.9172.525
5.0%0.8330.53.6672.525
8.0%1.3330.53.1672.525
12.0%2.000.52.52.525
15.0%2.500.52.02.525
20.0%3.3330.51.1672.525
1、丙烯酰胺30%为29：1（质量比，丙烯酰胺：双甲叉丙烯酰胺）
2、TEMED 可以加到1ul/ml。
不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围表
丙烯酰胺(%)有效分离范围(bp)溴酚兰*二甲苯青*
3.5100～2000100460
5.080～50065260
8.060～40045160
12.040～2003070
15.025～1501560
20.010～1001245
*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).
聚丙烯酰胺凝胶配方，凝胶的制备过程：
1、 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。
3、 按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。
4、 加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止。
5、 立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会。
6、 室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE缓冲液。
7、 小心取出梳子，加样。
6%的聚丙烯酰胺凝胶配方：30%聚丙烯酰胺（29：1）8ml,5*TBE 8ml,尿素16.8g,定容至40ml,加10%过硫酸铵200ul,TEMED20ul,室温凝固时间大于1小时
聚丙烯酰胺凝胶配方，而30%聚丙烯酰胺：丙烯酰胺29克，甲叉丙烯酰胺1克，水100ml
10%过硫酸铵：过硫酸铵1克，水10ml
5*TBE :Tris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(PH8.0)10ml,定容至500ml
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支撑介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N'-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚合进程需求有自由基催化完结。常用的催化聚合办法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合一般是参加催化剂过硫酸铵（AP）以及加快剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵发生自由基：以R·代表自由基，M代表丙烯酰胺单体，这样因为乙烯基"CH2=CH－"一个接一个的聚合效果就构成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延伸的丙烯酰胺链间构成甲叉键交联，然后构成交联的三维网状结构。氧气对自由基有铲除效果，所以一般凝胶溶液聚合前要进行抽气。丙烯酰胺的另一种聚合办法是光聚合，催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够发生自由基，催化聚合反应。一般光照2－3小时即可完结聚合反应。
聚丙烯酰胺凝胶的孔径能够通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来操控，丙烯酰胺的浓度能够在3％－30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有显着的阻止效果，可用于平板等电聚集或SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也能够用于别离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的效果，能够用于根据蛋白质的分子量进行别离的电泳中，如10％－20％的凝胶常用于SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的别离胶。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、通明度、粘度和孔径巨细均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是： C = 6.5－0.3T
上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的份额很重要。赋有弹性，且彻底通明的凝胶，a与b的重量比应在30摆布。选择T和C的经历公式是：
此式可用于计算T为5％～20％时的凝胶组成。C值并不很严厉，在大多数情况下，可改变的规模约为 ±1％，当C坚持恒守时，凝胶的有用孔径跟着T的添加而减小，当T坚持稳定，C为4％时，有用孔径最小，C大于或小于4％时，有用孔径均变大，C大于5％时凝胶变脆，不宜运用，试验中最常用的C是2.6％和3％。
聚丙烯酰胺凝胶配方配成30％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保留1个月，在贮存时间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而添加电泳时的电内渗表象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经体系有毒的试剂，操作时要防止直接触摸肌肤，但它们聚合后则无毒。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳能够使生物大分子在电泳进程中坚持其天然的形状和电荷，它们的别离是根据其电泳迁移率的不一样和凝胶的分子筛效果，因此能够得到较高的分辨率，特别是在电泳别离后仍能坚持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，关于生物大分子的判定有重要意义，其办法是在凝胶上进行两份一样样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行判定，另一半用于所有样品的染色，以剖析样品中各种生物大分子的种类和含量。
因为聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点，因此四十年来得到广泛的运用，当前尚无非常好的支撑介质能够替代它。其主要的优点有：①能够随意操控胶浓度"T"和交联度"C"，然后得到不一样的有用孔径，用于别离不一样分子量的生物大分子。②能把分子筛效果和电荷效应联系在同一办法中，到达更高的灵敏度：10－9 ～10－12 mol/L。③因为聚丙烯酰胺凝胶是由－C－C－键联系的酰胺多聚物，侧链只需不生动的酰胺基－CO－NH2 ，没有带电的其他离子基团，化学慵懒好，电泳时不会发生"电渗"。④因为能够制得高纯度的单体质料，因此电泳别离的重复性好。⑤通明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保留。⑥无紫外吸收，不染色就能够用于紫外波长的凝胶扫描作定量剖析。⑦还能够用作固定化酶的慵懒载体。
聚丙烯酰胺凝胶配方别离蛋白质开始是在玻璃管中进行的，玻璃管一般直径为7 mm，长10 cm，将凝胶装入到多个管中进行电泳，又称为柱状电泳。当前仍有运用，特别用于二维电泳中的榜首维电泳。但因为各个玻璃管的不一样以及装胶时的区别使每管的别离条件会有所区别，所以对各管样品进行对比时可能会呈现较大差错。后来开展起来的笔直平板电泳一次最多能够容纳20个样品，电泳进程中样品所在的条件对比共同，样品间能够进行非常好的对比，重复性也非常好，所以笔直平板电泳当前运用的更为广泛，常用于蛋白质及DNA序列剖析进程中DNA片段的别离、判定。
水平平板电泳这些年也有很快的开展，与笔直平板电泳比较也有其共同的优点：①因为凝胶能够直接铺在冷却板上，简单使凝胶冷却，因此能够加高电压以进步分辨率。②电泳速度快，一般只需1小时摆布，而园盘电泳和笔直平板电泳一般需求3～4小时。③因为能够运用薄胶，加样少，染色快，然后进步了灵敏度，并且简单保留，只需用甘油浸泡后天然枯燥即可长时间保留不会龟裂。④便于适用各种电泳方法，用处广泛，特别是能够运用90年代才开展起来的只需水平电泳体系才干运用的新的半干技能，即用浸有少数缓冲液的半干的胶条替代一般所用的大量电极缓冲液，大大节省了试剂，简化了操作，进步了电泳速度。
凝胶电泳作为检测DNA序列差异的有效手段，变性凝胶电泳在我室广泛使用，但是也有其使用范围。在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术，简称SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism，单链构象多态性）。
原理：在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）被变性成为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。
SSCP与变性凝胶电泳基本一致，不同之处有以下几点：
a． SSCP使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶（丙烯酰胺 80g，N- N，-亚甲双丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L）
b． 工作环境，由于SSCP受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V，电流50mA，单板电泳功率为9W，不用预热。缓冲液最好用新配制的。
c． 由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。室温在25。C以下。
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶配方电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析装载的样品容量大，可回收，DNA纯度高。在催化剂TEMED（N-N-N，- N，-四甲基乙二胺）和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N- N，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。
1.1 配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g
N- N，-亚甲双丙烯酰胺 1g
加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月
1.2 配制5×TBE缓冲液：
TRIS碱 54克
硼酸 27.5克
EDTA 3.72克
加水至1L
1.3 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积
试剂
制备不同浓度（%）凝胶所用试剂体积（ml）
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
水
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%过硫酸铵
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围
丙烯酰胺（%）
有效分离范围（bp）
二甲苯氰FF
溴酚蓝
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
45
12
2. 聚丙烯酰胺凝胶配方，聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤
2.1从NaOH池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶
2.2 把玻璃板拿到流动水处洗刷干净
2.3 洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干
2.4 用乙醇擦洗玻璃板
2.5 带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能（涂摸要均匀）
2.6 面板在下，背板在上。两侧用塑料板密封，并用夹子夹好。底部调节使之水平
2.7 将加入催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下，插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位
2.8 室温聚合30分钟，小心取出凹口处封条，用水冲洗加样孔（否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形）
2.9 将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里，面向缓冲液槽
2.10 用0. 5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V，电流150-200mA，单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。
2.11 点样之前需切断电源，用枪将点样孔的气泡及胶吹出，然后插入点样梳，注意不要插得太深，否则点样胶面会变形，影响美观及点样。
2.12枪吸加样品，PCR产物先加loading buffer 10ul ,再变性5分钟左右，接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样，点样完毕，电泳开始。
2.13 电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，放回原处。将面板进行银染
3. 电泳后的银染检测
3.1 原理：
影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子（Ag+）可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，这样核酸电泳带就染成了黑褐色。
3.2 银染
银染液的配制：称2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水
银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧，使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。
将加入银染液的银染盆放在摇床上后，将面板放入银染1小时左右。
3.3 显影
显影液的配制：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml
显影：将面板从银染盆里取出，在银染漂洗盆里漂洗，震荡5-6次，取出后使其表面尽量无水，再放入已加入显影液的显影盆里（显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行）显影过程大约10到15分钟，以DNA条带清晰可见为准。
将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。
本实验室凝胶电泳相关常用试剂配方：
1. 我实验室常用的聚丙烯酰胺凝胶是6%变性聚丙烯酰胺凝胶（简称变性胶，PAGE），就是在普通聚丙烯酰胺凝胶中加入变性剂。我们使用的变性剂是尿素。
6%PAGE具体配制方法为:
尿素210g，10×TBE 25ml ，丙烯酰胺28.5 g ，亚甲双丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，过滤后使用。
考虑到方便使用的问题，一般一次配制2L（尿素840g，10×TBE100ml，丙烯酰胺114g，亚甲双丙烯酰胺6g）。
2. 10×TBE（Tris-硼酸-EDTA）的配制
EDTA 7.44g，硼酸55g，Tris 108g，加水定容至1000ml
3. 10%过硫酸氨（AP）
10g过硫酸氨，纯水定容至100ml
4. 硅化剂配方
二甲基二氯硅烷：无水乙醇=13ml：500ml
5. 反硅化剂（粘合剂）配制
无水乙醇 500ml（一瓶），44ddH2O，3.3冰醋酸，550ul Bind silnce（3，-Trimethoxysilyl propyl）
配置完遮光4。C保存
6 loading buffer 配制
0.1g 二甲苯氰，0.1g 溴酚蓝，1ml 0.5molEDTA ，100mL甲酰胺
以总体积为8ml的5％的浓缩胶为例，
水：5.5ml
30%丙烯酰胺溶液：1.3ml
1.5mol/LTris(pH8.8)：1.0ml
10%SDS：80ul
10%过硫酸氨：80ul
TEMED：6ul
胶不凝或凝得慢，增加过硫酸铵的量到100ul或增加TEMED的量到10ul，不会影响电泳效果。
两种方法原理不同，有差异是正常的。如果差距较大，要仔细分析。
一般凝胶层析是非变性的，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是变性的，二硫键也被还原，所以是亚基（肽链）分子量。
聚丙烯酰胺凝胶配方，凝胶层析与分子形状有关，一般marker都是球状蛋白，所以测球状蛋白分子量较准。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与分子形状无关。
有些蛋白性质特殊，不适于用SDS-凝胶电泳法测定。比如结构特殊的，如胶原；带很多电荷的，如组蛋白；带有较大辅基的，如糖蛋白。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量，为什么有时和凝胶层析法所得两种方法原理不同，有差异是正常的。如果差距较大，要仔细分析。
本文推荐企业：山东东达聚合物有限公司（http://www.sdpamchina.com/)，是专业的阴离子聚丙烯酰胺，阳离子聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺生产厂家，专业生产聚丙烯酰胺,阴离子聚丙烯酰胺,阳离子聚丙烯酰胺,非离子聚丙烯酰胺。拥有雄厚的技术力量，先进的生产工艺和设备。东达聚合物有限公司全体员工为海内外用户提供高技术,高性能，高质量的聚丙烯酰胺产品。专业聚丙烯酰胺生产厂家：山东东达聚合物有限公司热忱欢迎国内外广大客户合作共赢。