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马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

发布日期:2015-05-05 13:20:28
马铃薯
微卫星序列又称简单序列重复(Simple sequ?ence repeat, SSR) , 是广泛分布于真核生物基因组 中的高度重复序列。在动植物研究方面,目前己成 为遗传连锁分析、基因定位以及遗传标记图谱构建 等领域一个极为重要的研究手段[1,2]。典型的微卫星 DNA重复单位的核心序列为2~6 bp,重复次数为 10~20 次,长度一般为 100~300 bp。
 
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel elec?trophoresis, PAGE) 技术由于其检测灵敏和分辨率高 的特点,特别适合于小片段多态性扩増产物条带的检测,并且分离效果好,分辨率高。理论上,不同浓度马铃薯的凝胶在一定范围内,凝胶的浓度越大,分辨 率越高,对长度差异片段区分性越好,越有利于基 因型的判断。扩増片段检测目前主要采用溴化乙锭 (Ethidium bromide, EB)染色与硝酸银染色[3]。银染 由于染色背景较深,非特异性条带较多,品种之间 的特异性条带不易区分,不利于进行品种纯度方面 的鉴定分析[4];聚丙烯酰胺淬灭EB的荧光,使EB 染色的灵敏度降低,但是此方法操作时间短、程序 简单、背景颜色浅、成像容易,使得SSR扩増的 多态性目的条带带型清晰,数量也能够满足实验分 析要求。另外,EB染色结果具有一致性,重复性 好的优点,成为品种鉴定方法中条带染色的首选方 法。
 
本试验拟通过对聚丙烯酰胺凝胶电泳参数的分 析,确立马铃薯品种纯度鉴定中标记产物的最佳电 泳体系,以满足试验分析的需要,同时为马铃薯主 栽品种DNA指纹图谱的构建打下理论基础。
 
1材料与方法1.1试验材料本试验选用的马铃薯为黑龙江省主栽品种,由 黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所提供(表 1)。
 
SSR标记所用引物序列由加拿大蒙特利尔麦吉 大学科研组提供(表2),并由上海生工生物技术公 司合成;其它试剂(TaqDNA聚合酶等)均购自大连 宝生物试剂公司。
 
表1试验用马铃薯品种序号品种名称级别1早大白原原种2黄麻子原原种3克新13号原原种4荷兰15原原种5大西洋原原种表2 SSR标记所用引物序列情况引物编号序列顺序^到30SSI-FTCT CTT GAC ACG TGT CAC TGA AACSSI-RTCA CCG ATT ACA GTA GGC AAG AGAPatatin-FCAA CCA ACA AGG TAA ATG GTA CCPatatin-RTGG TCT GGT GCA TTA GAA AAA ASTM0014-FCAG TCT TCA GCC CAT AGGSTM0014-RTAA ACA ATG GTA GAC AAG ACA AAUGP-FGAA ACT GCT GCC GGT GCUGP-RTGG GGT TCC ATC AAA C电泳操作如上,比较不同电压电泳结果的差异。
 
表3不同浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制凝胶浓度5%8%12%16%30%丙烯酰胺储液(ml)1.662.6645.25 X TBE (mD222210%过硫酸胺(APS) ([xL100100100100四甲基乙二胺(TEMED) (pH10101010双蒸水(mL6.845.8442.8分离的DNA大小(bp)80~50060~40040~20020~1001.2试验方法1.2.1马铃薯块茎DNA提取米用Isolation buffer提取液提取马铃薯DNA, Isolation buffer 提取液配方如下:100 mM Tris (pH 8.0),50 mM EDTA (pH 8.0),1.3 M NaCl, 0.2%SDS,0.5% Triton X-100, 1% PVP, 10 mM DTT,60 mM b-mercapto ethanol,其它操作步骤同 一般SDS提取方法[5,6],并用Alpha Innotech公司的 December 2006型紫外凝胶成像仪检测结果。
 
1.2.2SSR 标记PCR反应体系(20 |xL):10xPCR 缓冲液 2 |xL,10 mM dNTPs 0.8 |xL, 25 mM MgCl2 2.4 |xL,Taq DNA 聚合酶(5 U /|xL) 0.15 ^L,4mM上游引物1 ^L,4mM下游引物1 |xL,灭菌双蒸水11.65|xL,模板DNA60ng。
 
PCR扩増程序:95T:预变性 5 min; 94T:变性 30 s,48.5T:复 性45 s,72T:延伸90 s,共35个循环;72T:延伸 7 min,在 Biometre 公司 T-Gradient Thermoblock 型号PCR扩増仪上扩増,产物4丈保存。
 
PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,EB染 色,紫外凝胶成像仪检测结果。
 
1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳参数分析(1)不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳比较分别配制5%、8%、12%、16%的聚丙烯酰 胺凝胶,所需各种试剂及用量如表3,预电泳 30 min 后,取 PCR 产物 5|xL 与 1|xL 6-Loading Buffer混匀,上样,电泳,EB染色,紫外凝胶成 像仪检测结果。
 
(2)电压变化对电泳结果的影响设置电压梯度为330V、250V、170V、90V,(3)凝胶染色方法比较①银染方法:A.银染液的配制:固定液(100 mL冰乙酸加水 稀释至 1 000 mL);染色液(2g AgNO3、1.5 mL 37%甲醛,加水稀释至1 000 mL ;显色液(30 g Na2CO3、1.5 mL 37% 甲醛、0.2 mL Na2S2O3,加水 稀释至1 000 mL ;终止液(10%冰乙酸。
 
B银染法操作:固定30min—去离子水洗涤5~ 10 min—?染色30 min—?去离子水洗潘2次(每次不 超过30 s)—显色至所要程度^终止显影。
 
②溴化乙锭(EB)染色:将EB贮液(10 mg ‘mL-)用双蒸水稀释至 0.5 ^g’mL-1,将电泳后的凝胶放入染色液中30 min,染色后的凝胶放入蒸馈水中清洗5 min,再 将凝胶放入紫外凝胶成像仪观测结果。
 
2结果与分析2.1 DNA提取结果将5个马铃薯品种提取的DNA,各取5 ^L, 与16-Loading Buffer混匀,用1%琼脂糖凝胶,100 V电压,电泳30 min,结果用紫外凝胶成像仪 检测。从电泳结果可以看出,用Isolation buffer提 取液提取的马铃薯DNA,质量好,主带唯一,无 拖尾和弥散,能够满足SSR标记的要求(图11。
 
2.2不同参数电泳结果比较2.2.1不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶,凝胶的孔径大 小、分辨率不同,分离效果也明显不一样(图2)。 凝胶浓度较低时一5%,胶的分辨率明显不好,SSR 标记扩増的多态性条带数量少,带型模糊,不利于 带型区分、品种区分;12%和8%浓度的凝胶相比, 多态性条带数量多,带型清晰,品种之间的区分更 明显;16%浓度的凝胶电泳,多态性条带数量并没 有较12%浓度的凝胶有明显的増加,并且由于电泳 时间过长,单一条带反而有些离散,不如12%浓 度的凝胶条带集中、明亮,同时配制16%浓度的 凝胶所需要的相关试验试剂的用量也比较大,试验 成本也会相应増加。
 
3—12%浓度的 PAGE; 4—16%浓度的 PAGE。
 
(泳道对应的马铃薯品种顺序与表1对应,M为标准分子质量2.2.2不同电压下的电泳结果在实际电泳操作中,不同电压下的电泳对应的 时间、电流参数如表4。
 
表4不同实际操作电压下的时间、电流参数值电压(V)工作参数电流(mA)时间(min)
 
330928025057150170462609026460在330V电压下,电泳只需要80 min就能完 成,但是因为电泳速度过快,标记的多态性条带不能完全分离开来,并且条带不清悉;90 V电压下, 电泳结果比较好,能够满足实验分析的需要,但是 电泳时间太长,接近8个小时;250 V、170 V电 压均能将泳道中的多态性条带分开,满足试验分析 的需要,并且,170 V电压电泳,多态性条带更清 晰,可以采用(图3)。
 
2.2.3PCR标记产物不同染色方法的结果比较 EB染色,多态性条带清晰,背景浅,并且同 一品种多次扩増成像一致,便于实验结果分析;银 染法随着时间的増长,背景逐渐加深,显示的多态 性条带数目増多,目的条带相近的细小条带(俗称 影子带)也在増多,若对目的条带带型不是很了 解,则不利于基因型的判断,对多态性信息量、简 单匹配系数等的试验分析也容易出现错误。比较结 果如图4。
 
1001234图3不同电压下的电泳结果1 一电压为330 V; 2 —电压为250 V;3—电压为170V; 4—电压为90V。
 
(泳道对应的马铃薯品种顺序与表1对应,M为标准分子质量12 3 45M12345M12345M12345M12345M1000100010001 1500 爸;;500500- 500- 500P 500400— 400—400—400^400300— 300—300-300"300■ _ _ _ ■图4SSR标记产物不同染色方法结果比较1—标记产物EB染色结果;2—银染20 min结果;3—银染30 min结果;4—银染50 min结果;5—银染70 min结果。
 
(泳道马铃薯品种顺序与表1相同,M为标准分子质量3结果与讨论SSR标记与其它标记方法(RFLP、RAPD、 AFLP等)相比,具有共显性遗传,符合孟德尔遗传 规律,数量丰富,分布均匀,覆盖整个基因组, 试验重复性好,结果可靠性高等优点[7,8],是马铃 薯品种纯度鉴定分析的理想的分子标记。SSR标记 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的检测方法, 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨力极高,用于测序的聚 丙烯酰胺凝胶可分离相差1 bp的DNA片段,能 够将品种特异性的谱带分离出来,进而判定纯度 和真实性。但是对凝胶结果影响因素较多,不同 的试验处理对成像结果都有影响,影响大的以至 于不能进行试验结果的分析,因此,需要对聚丙 烯酰胺凝胶电泳参数进行优化,聚丙烯酰胺凝胶的 浓度、电泳时间都是其中重要的参数,试验结果表 明:在聚丙烯酰胺凝胶的浓度为12%、电泳电压 为170V的情况下,PCR标记产物多态性条带清晰、 明亮、稳定,便于试验分析与交流。PCR扩増产 物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,目标产物的检测 主要采取显色法。目前大多采用同位素放射自显影 法、荧光染料标记法、EB染色法和银染法,放射 自显影法操作过程比较繁琐,且操作者容易遭受同 位素照射的危险,在推广应用中有一定的难度;荧 光染料标记法操作过程同样繁琐,试验成本较高; 银染法其检测的灵敏度接近于同位素检测,但是整 个银染检测操作步骤也非常繁锁,染色花费的时间 也较长(染色1次约需要2 h),同时,使用到的配 制试剂较多,试验稳定性也难以控制,不利于品种 鉴定[9]; EB染色法方便易行,时间短,全程只需要 35 min操作比较简单,只需要配置一种溶液,采 用两个步骤,紫外凝胶成像仪成像方便,并且EB 染色结果稳定,利于试验分析。但是EB具有致癌 性,对人身体健康有害,因此,找到一种更好的染 色方法,既有利于试验分析,又不危害身体,对 SSR标记方面的研究是非常必要的。