聚丙烯酰胺体系中原油的生物降解作用研究：
聚丙烯酰胺体系中原油的生物降解作用研究，油田采出水的处理是目前油田亟待解决的重要问题之一。聚合物驱采出水中 聚合物的存在对水处理产生一定影响。目前我国各大油田使用的聚合物主要为部 分水解聚丙烯酰胺（partially hydrolylamide polyacrylamide, HPAM)。
HPAM是一种线型高分子聚合物，结构单元中含有酰胺基，极易与其他化合 物形成氢键，PAM具有一系列性能如：水溶、增粘、流变、分散、絮凝、减阻、 表面活性等。聚合物驱是一种改性水驱，采油污水具有水量大、成分复杂和难以 处理的特点，其中高粘度、强乳化稳定性和可生化性更差是其区别于其它采油污 水的主要特征。
油田生产过程中产生大量污水，在进行回注或者外排之前水体中各种成分需 要控制在一定标准，污水中含有的原油是处理的重要组分之一，而生化处理是污 水处理过程中的一个重要步骤。HPAM的存在对含油污水处理的产生较大影响， 主要表现为：采出污水中含有聚合物，造成污水粘度增加；采出污水中油珠变小 了；采出污水中悬浮物物质增多，去除更加困难。HPAM对污水中原油的存在形 式产生影响，溶液性质、微生物生长环境也会发生改变。
本论文是在聚丙烯酰胺环境中对原油进行生物降解研究。论文内容分为五部 分。第一部分为文献综述；第二部分是HPAM乳液中原油的回收率；第三部分 是原油的生物降解；第四部分是HPAM存在条件下，细菌对原油的降解作用； 第五部分是存在问题和展望。
本论文主要研究内容为在HPAM存在条件下微生物对原油的降解作用。通 过实验研究主要得出如下结论：
1.对本论文所用到的聚丙烯酰胺的分子量进行了测量，计算得到聚丙烯酰胺 的粘均相对分子质量M=9.184x106。淀粉碘化镉法能够更好的适用于测定复杂水 质中的HPAM浓度。HPAM水溶液相对粘度相对于其浓度呈指数增长，在单一 盐效应作用下，仍保持指数增长模式。在HPAM与原油形成的的乳状液中，当 通过调节pH、投加无机盐、灭菌、机械剪切等手段使HPAM溶液粘度降低时，
原油回收率则相应提高。
2.筛选出3株对原油具有一定降解效果的细菌并定性考察了 3株细菌的生 理生化性质;通过构建优势混合菌，并优化出细菌降解原油的环境条件为:pH =7, 最佳盐度为NaCl=3g.L-1，温度35°C;初步探索了添加PAM对细菌生长及对原 油降解效果的影响。添加HPAM对细菌生长具有一定促进能力，原油降解率略 有提高
4.在聚丙烯酰胺环境中，经发酵罐控制连续发酵7天，三株细菌对原油具 有良好的降解效果。细菌对原油组分中的大部分烷烃和芳烃都具有明显降解效 果，对烷烃总体降解率为70%,对芳烃总体降解率为80%。因为聚丙烯酰胺的 存在，原油发酵时乳化明显，发酵结束后体系中原油发生了絮凝沉降。
油藏储存在地层中，在石油的开采过程中，采出的石油通常都具有一定的含 水率。在油田初级开发阶段，当钻穿油层完井后，原始地层压力可推动部分油、 气、水等汇聚井底，并沿钻井升至地面。像这样，依靠地层天然能量克服重力及 其它阻力而被举升原油的生产方式称为自喷采油，也称之为一次采油，此种采油 方法，采出原油中水分比例很低。当地层压力降低后对油田进行注水开发和注气 开发等方式。注水开发是国内外普遍采用的油田开发方式，通过注水对油层补充 能量，是保持油层压力、延长自喷采油期、提高采油速率和采收率的一项重要措 施。当向地层注入水量达到一定程度后，注入水和原油一起被采至地面，当油藏 储量减少，注入水则不断增多，伴随开采的进行，采出液中含水率不断上升。随 着我国陆上石油生产的不断进行，大部分油田自喷采油阶段已经结束，而进入到 中后期开采阶段，通过改变注入水的特性提高油田采油率已成为主要的开采方 式。目前，世界上采用“提高原油采收率（EOR)”这个术语来概括除天然能量 采油和注水、注气采油以外的任何采油方法。通称的EOR方法主要有：热力驱 油法、混相驱油法和化学采油法等。以聚合物驱油为代表的三次采油技术在我国 陆上油田得到推广应用。聚合物驱是一种化学驱油法，即通过在注入水中加入化 学试剂（高聚物）来改善水的驱油及波及性能，进而提高采油率的方法。
在自喷采油中，原油含水率很低。而通过注水或在注入水中添加化学试剂来 提高采收率，一些油田开采后期，采出液的综合含水比例会超过90%。而对原油 进行脱水处理是在原油作为成品外输前的必要步骤，经油水分离，油田生产过程 中产生大量含油污水。
在对含油污水的无害化处理过程中，降低原油含量是一个重要指标。随着聚 合物驱在我国油田的应用，产生了大量的含油含聚污水，聚合物的特性使油田采 出污水性质发生较大变化，现有污水处理工艺出现不适应，处理效果变差。在对 此类污水的生化处理过程中，聚合物的存在对原油去除能力会产生影响，本论文 从含油污水中筛选得到对原油具有降解和絮凝效果的三株细菌，以含油含聚污水 作为研究对象，考察了含聚丙烯酰胺的油田污水中细菌对原油的降解作用。
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1.文献综述
在我国的油田开发建设历史上，从20世纪60、70年代着手研究油田含油污 水处理工艺建立含油污水处理系统，在油田环保方面取得了较大的成绩。但是到 目前为止油田环保工作仍明显落后于油田生产发展，滞后于国家环保要求。油田 污水的不达标回注和外排，会对环境造成污染，影响油田地面设施的正常运作， 而且还可能堵塞地层而带来危害，影响油田安全生产。
注水开发对油田生产至关重要，但也带来了诸多问题。其中两个显著的问题 就是注入水的来源以及污水的排放问题。油田是用水大户，清水通常来自于地表 水或开采地下水，为油田生产提供量大而稳定的水源是油田稳定生产的保障，而 水资源的过度消耗及地下水的过量开采会给生态环境造成压力；随着地下原油在 水驱作用下不断被开采到地面，采出液中，原油比例会逐渐降低，而含水量却在 不断的上升，为了保证原油较低的含水率，越来越多的水分需要经脱水站处理脱 去，从而大量的含油污水就产生了。采油污水是油田污水的主要组成部分，随着 含油污水的大量增加，需要按照国家有关水质标准对污水进行合理的排放和处 理，否则会对油田生产产生阻碍并会对受纳水体、土壤等产生潜移性侵害，超过 环境容量后对生态环境产生危害[1]。
大量的污水经污水厂处理，去除或降低污染物含量达标后，进行回注。但随 着随着污水量规模的增大，已超出注入水量要求，相当一部分含油污水必须外排。 在聚驱采油过程中，高含水后期是我国各大油田生产的现状，由于聚合物的使用， 需要低矿化度的清水配制聚合物溶液，致使大量外源清水注入系统，从而会使产 出的污水无法全部回注。同时由于污水处理工艺比较落后，大量污水的不达标外 排；另外由于油水井作业及洗井污水的无处理外排也对环境造成严重污染 。
聚合物驱，在保证我国油田原油稳产中发挥着不可替代的重要作用，但由于 聚合物的稳定性，在采出水中大量的聚合物分子仍然存在，而经油水分离后产生 的污水相对粘度较大，容易形成的比较稳定的乳液，致使水相中含油量偏高，从 而使污水处理难度增加。
1.1油田污水组成
1.1.1油田采出水
在采油过程中，石油的主要天然伴生物是水。在油藏开采初期，自喷采油过 程中，采出原油含水率较低。但是如果油藏密闭良好，随着原始地层能量递减， 自喷采油方式将难以继续。为了提高采收率，则向地层进行注水或注气的方式来 提供能量。注水开发方式应用较广，但随着开发时间的延长，注入水与原油一起 采出，使原油含水率不断增加。油田原油在外输之前需要将水分控制在一定比例 之下，多余水分需要脱出。在原油脱水站处进行油水分离处理就会产生出大量的 污水，而污水中主要污染物之一就是原油，通常将在油田开发过程中产生的此类 污水称为油田采出水。油田采出水除含有原油外，还包括从地层中随原油一起携 带至地面的各种无机盐、有机物以及悬浮颗粒等。
在油田的中后期注水开发时期，油田助剂有相当规模的应用，添加各种性质 的助剂对注入水进行改性处理，改性注水是保持油田地层压力、提高采油率的必 要措施。而化学驱主要包括：聚合物驱，通过在注入水中加入高聚物来改善水的 驱油和波及性能进而提高原油采收率的方法；碱驱，以碱（氢氧化钠、原硅酸钠、 硅酸钠、碳酸钠等）的水溶液作为驱油剂的方法；表面活性剂驱，用表面活性剂 体系作为驱油介质的驱油方法；复合驱，两种或两种以上的驱油成分组合起来的 驱动；混相驱，以混相注入剂（注入地层后在一定条件下能与原油混相的物质） 作为驱动介质的方法。
由于注入水中添加有各种助剂，以上所述各种化学试剂则会在采出水中以各 种形式存在。改变注入水，使油田采出液含水量不断增加、成分更加复杂。油田 采出水是一种以水为主体，水体中含有固体杂质、各种形态的油类、无机盐离子、 有机物、微生物以及溶解气体类等物质。通过对国内主要油田污水水样的分析， 发现具有如下特点：矿化度高、含油量高、含有大量易于结垢离子、悬浮颗粒类 含量高、含添加剂（聚合物） 。
目前，我国陆上大油田如大庆油田、长庆油田、辽河油田等，已经走过自喷 采油阶段而陆续进入中后期开采阶段，中后期生产的一大特点就是高含水率，大 庆油田部分处于开采后期的板块[4]，油井采出液的油水比低于1:9。注入水和改 性注入水是采出液中含水率升高的主要原因，从而导致大量多余采油污水的产 生。特别是聚合物驱油技术成熟应用，在提高采收率的同时，采出水中残留的高 浓度聚合物分子导致污水处理难度进一步加大。回注水质不达标，有可能导致堵 塞渗油口、管线易腐蚀结垢、注水压力升高等一系列问题[5]。因此，油田污水处 理是国内外研究的热点，利用新技术、新工艺对采油污水进行有效处理，使之达 到回注及外排的水质标准，是目前油田开发生产的重要任务之一。
1.1.2钻井污水
钻井污水是钻井过程中产生的废水，主要是钻井液的高倍稀释所形成的混合 物。钻井液是指钻井中使用的工作流体，它可以是液体或气体，主要是用来冲洗 井底、携带岩屑、平衡地层压力、冷却与润滑钻头等。钻井液由分散介质（水、 油或气体)、分散相（粘土、油、水或气体)、钻井液处理剂（酸、碱、盐表面活 性剂等）组成。
目前国内油田钻井过程使用的钻井液体系主要包括：钙盐处理钻井液体系、 聚合物钻井液体系和磺酸化钻井液体系[6]。钙盐处理钻井液主要由水溶性钙盐、 烧碱、清水、泥浆稀释剂及降失水剂等有机处理剂组成；聚合物泥浆主要是由清 水、聚合物类（聚丙烯酰胺、聚丙烯酸盐等）处理剂组成；磺酸化泥浆体系主要 是由清水、搬土、烧碱和各种有机处理剂组成。
钻井污水主要由以下三部分组成[7]:①地面废水，它是由油井场地表面的雨 水冲刷汇集而成，主要组成为地表的泥沙、少量的残油、钻井液等。②钻井过程 中冲洗动力设备而产生的污水，其中主要污染物为石油类和少量的钻井液。③钻 井机械设备废水和井底返回水，即洗井液，它是由冲洗砂样，钻井机械设备及钻 井返回地面的水产生的，其中污染物主要是钻井液，这部分废水量大，组成复杂。
在目前油田钻井开发过程中，现有的泥浆体系不可能从开钻直至完钻都能完 全适应钻井全过程的要求，中途需要多次倒换钻井液体系，在此过程中，许多泥 浆会从井中溢出，从而失去可利用性，产生大量的废弃泥浆，而这部分废弃泥浆 几乎完全排向污水池，致使废水中的各种有害物的浓度激增。钻井污水虽然来源 于上述三大部分，但最终的成份远比上述分析的复杂且浓度很高。从某种意义上 讲，钻井污水是稀释后的钻井泥浆[8]，钻井污水的污染物主要包括钻屑、石油、
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粘土、聚合物、有机和无机助剂、重金属等。钻井污水具有高度不稳定性、多变 性、复杂性和分散性等特点。 1.1.3其它类型污水
采出水和钻井液是油田污水的主要组成部分，而油田生产过程中产生的任何 含油或含有其它污染物的水体都是油田污水的组成部分，例如对油田生产设备、 储运工具进行清洗，地表径流冲刷生产板块而产生的含油污水等；另外由于发生 事故而造成原油泄漏进入水体也构成污水[9]。油田是消耗水资源的大户，也可以 说油田是产生污水的大户，由于油田地质条件差异及生产差异性，各油田污水处 理站要处理的污水水质差异大，而且水质变化大，油田污水处理任务仍十分艰巨。
1.1.4油田污水水质成分
油田污水中存在的物质成分，可以粗略分为五类，主要包括[10，11]:
(1)悬浮物质：①粘土和各种粒径的砂粒；②因腐蚀而产生的镑或污垢：铁 锈、水垢、硫化物、钙盐等；③微生物：主要是硫酸盐还原菌（SRB)和腐生菌
(TGB);④油分中沸点高而不溶的錯质、胶质浙青质等。
(2)胶体：粒径为1x1〇-3〜1pm。水体中大分子物质或有细微结构的有机物会 形成胶体，并吸附部分粘土颗粒和微生物等，类似于悬浮物质。
(3)浮油和分散油：采出水中的原油大部分在水面形成浮油，并有部分以小 颗粒状分散于水体中形成分散油。
(4)溶解油和乳化油：油田采出水中约有10%比例的原油以乳化状态存在。 还有极少比例的原油的呈溶解态。
(5)溶解物质：部分小分子物质及离子在水中处于溶解状态，主要包括：① 溶解在水中的无机盐类。基本上以阳离子的形式存在，油田采出水的矿化度一般 都会很高；②溶解气体。如硫化氢、二氧化碳、氧气、烃类气体等。
油田污水是一个复杂的体系，一般具有以下特征[12-14]:
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Table 1-1 Sewage characteristics
含油量高矿化度高细菌 DO低COD高 pH偏高
>1g/L20-50g/LSRB、TGB -可达几万 mg/L>7.5
1.2油田污水处理存在的问题
油田污水处理的难易程度随其来源及油污的状态和组成不同而有差异。采油 污水处理方法按原理可分为物理法，化学法，物理化学法，生物法等[15]。从前面 描述可知，油田污水中的原油会以多种状态存在，而且污水中还含有其他杂质， 单一方法通常达不到良好的处理效果[16]。要使油田污水达到排放或利用的标准， 各油田目前在污水治理上存在以下主要问题[17]:
(1)我国主要陆上油田进入高含水后期，油田产生大量污水需要外排。一方 面由于注入水中添加聚合物后，需用低矿化度的清水来配制聚合物溶液，注入水 系统中则引入大量的清水水源，导致供水、注水系统不平衡，产出的污水无法全 部回注，同时由于污水处理工艺比较落后，大部分采出水达不到排放标准直接外 排造成环境污染；另一方面，在油水井作业及洗井过程中，产生的污水无处理就 地外排，对环境污染严重。
(2)采出水成分日趋复杂化，处理难度加大。聚合物驱和其他二元、多元化 学驱油相继开展。由于聚驱采出水中含有一定浓度的聚合物分子，分离出来的污 水相对粘度较大，易于形成稳定的乳化油，使油水分离难度加大。另外在油田开 发生产过程中，地面工艺加入的破乳剂、缓蚀剂、防垢剂，采油工艺加入的杀菌 剂、防蜡剂和其它工段加入的酸碱、有机物等都会随之集中于污水处理站。污水 沉降时间长、加药量增多、过滤压力升高、反冲洗时间延长、反冲洗周期缩短、 水驱污水站处理能力下降等。
(3)从深度污水处理技术来看，我国各主要油田处理技术相对落后，使得水 处理过程中悬浮物含量超标、悬浮物粒径不合格的现象很普遍。急需找一种采出 水专用的精细过滤设备。
(4)从采出水除油设备来看，各主要油田多采用的是重力沉降罐。气浮、水 力旋流及压力沉降等除油设备只有少量应用。地面设施庞大、工艺复杂、生产成
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本高、建设改造费用大，已不能适应高含水后期油田开发的需要。
1.3 PAM在采油中的应用及对水质的影响
1.3.1聚丙烯酰胺的化学特性及应用
聚丙烯酰胺是一种线型高分子聚合物，碳链骨架上连接有酰胺基或羧基，易 形成氢键，使PAM分子有着良好的水溶性及较高的化学活性[18]，并能通过枝接、 交联作用形成改性聚合物，从而PAM本身和其一系列的衍生物具有多种使用特 性，比如将PAM作为絮凝剂、增溶剂、表面活性剂使用等。其中PAM在工业 中的应用性质[19-21]有以下几个：
表1-2 PAM性质 Table 1-2 Characteristics of PAM
性质表现形式
水溶性易溶于水，与不溶于水的高分子改性桥接增加其水溶性
增粘性分子量高，水溶液粘度高；与水溶液中的其它分散剂发生作用而增粘
流变性剪切稀释性、剪切增稠性、触变性
分散作用降低水的表面张力、增加溶液的润湿性、阻止颗粒聚并
絮凝作用使悬浮物质通过电中和、架桥吸附作用絮凝
减阻作用有效降低流体的摩擦阻力，降阻50%-60%
如上表所述，高分子化合物聚丙烯酰胺的独特性质决定了它的广泛应用，因 而聚丙烯酰胺又被称为“百业助剂，，[22,23]。
PAM在聚合物驱采油、水处理等行业也具有广泛的应用，在石油开采中， 聚合物驱提高采油率和钻井液材料均用到聚丙烯酰胺，不同结构种类的聚丙烯酰 胺具有不同的性质，根据其功能性应用于钻井、压裂、强化采油等各个作业工段。 我国陆上油田包括大庆油田、胜利油田等开采已经步入中后期，主要通过在注入 水中添加阴离子聚丙烯酰胺水来改善油水流度比，提高原油采收率，并推广聚合 物驱油和三元复合驱油技术[24]。
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H H
I I
C—C
I I
HC=O
x
C一C_
I I
H ^=O
y
HH
聚合物驱是以聚合物溶液作为驱油剂的驱油法，也称为聚合物强化水驱、聚 合物溶液驱、增粘水驱和稠化水驱。应用于驱油主要为部分水解聚丙烯酰胺 (HPAM)其分子结构[25]如下：
NH2
图1-1 HPAM分子结构 Fig.1-1 The molecular structure of HPAM
聚合物驱较普通水驱能提高采收率5%-15%。一方面，聚合物驱主要是利用 聚合物增加注入水的粘度，降低油水流度比，从而增大注入水的波及系数。聚合 物对水的稠化能力产生原因：（1)浓度增大后，聚合物长链分子会纠缠在一起， 产生结构粘度；（2)聚合物分子链段中含有亲水基团，溶剂化增粘；（3)离子型 聚合物在水中离解形成双电层，互相吸引增粘能力显著。另一方面，在常见亲水 地层，聚合物通过色散力、氢键等作用力容易吸附在岩石表面。当注入水通过时， 吸附层薄膜发生膨胀，降低了水相通过岩层的有效渗透率，吸附层与油层接触时 则不会出现膨胀现象。因此，在含油饱和度很低的油层中改聚合物溶液驱油，可 显著降低水的流动度，减弱其舌进、指进的趋势，最终达到提高采油率的目的。
1.3.2聚合物驱采油污水
聚合物驱油技术从国外引进，在“八五”期间被列为国家科技攻关项目，自 “九五”之后，聚合物驱油技术在我国陆地各大油田开采面积及产量不断增加， 在保证我国油田稳定产油中发挥着重要作用。例如在大庆油田2006年油田生产 总产量中，聚合物驱原油产量为总量的27%。聚合物驱在给油田带来可观效益的 同时，也带来亟待处理的问题，主要就是采出水达标外排的问题。聚合物驱是一 种改性水驱，因而与水驱采出污水相比，聚驱采出污水的性质也相应的会发生变 化，大量的聚合物存在，使污水含油量增高，处理难度加大。总的来说油田采出 水中聚丙烯酰胺的存在，会对含油污水处理造成以下影响[26-28]:
①采出水中聚丙烯酰胺的存在，增加的污水粘度。普通水驱采出水的粘度一 般为0.6mPa.s(45°C)，聚合物含量越高，米出污水的粘度也越大，一般聚驱米出
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水的粘度范围约为0.8〜1.1mPa.s(45°C);聚丙烯酰胺大分子结构易于与水体中的 胶体颗粒通过吸附等作用，增加悬浮物的稳定性，从而使污水处理自然沉降时间 相对延长。
②采出水中油珠粒径相对减小。粒径测试发现：聚丙烯酰胺的存在会使采出 污水中90%的油珠粒径小于10pm；另外微观测试结果表明：采出水中的小油珠 稳定存在是因为聚合物分子增大了油珠界面电荷和油水界面膜强度。
③由于阴离子型聚丙烯酰胺的存在，会使部分絮凝剂作用效果变差，从而需 要投加更多的药剂。经常规工艺处理，处理后的污水中悬浮固体颗粒、原油浓度 等指标难以达到原有水质标准，甚至会严重超标。
④聚合物溶液吸附并携带大量泥沙量。利用聚合物的性质，增加水溶液对原 油的作用力，而同时溶液也会将泥沙等固体颗粒吸附，大量泥沙的存在缩短了污 水站反冲洗周期，增加了工作量，从而能也就降低了污水处理厂的处理效率。 1.3.3水质标准
油田采出水经处理后回注或外排，目前我国现行的聚合物驱污水回注标准主 要依照国标（GB 8978-1996) [29]如表:
表1-3聚合物驱污水水质回注标准 Table 1-3 Rejection standard of polymer flooding swage
渗透率/^m2<0.10.1-0.6>0.6
油含量/mg • L-1彡 10.0<15.0<30.0
悬浮固体含量/mg • L-1彡5.0<15.0<30.0
颗粒粒径中值/^m彡2.0彡3.0<5.0
聚合物驱污水经处理之后外排，则执行国家污水外排指标。处理后的油田污 水一般应达到一级排放标准。
表1-4污水综合排放指标 Table 1-4 Sewage discharge index
污染物一级标准二级标准三级标准
石油类（mg/L)101030
悬浮物（mg/L)70200400
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COD (mg/L)100150500
氨氮（mg/L)1225-
挥发酚（mg/L)0.50.52.0
pH6-96-96-9
根据对三次采油废水的水质资料和水质特征的分析，三次采油污水中，聚合 物驱采出水的粘度随HPAM含量的增加而增加，HPAM分子上的酞胺基吸附水 中的油滴和悬浮物，并包裹在颗粒表面，增加了其稳定性。在利用微生物处理三 次采油污水，聚合物和原油是主要的作用对象。大庆某油田经污水处理站处理后 的污水水质如下表：
表1-5聚合物驱采油污水的主要参数
Table 1-5 The main index of polymer flooding sewage
分析项目水质参数
油浓度/mg • L-17.5-35.6
悬浮物浓度/mg • L-110.0-33.2
颗粒粒径种植/p2.8-8.0
PAM 浓度/mg • L-194-181
COD/mg • L-1326-538
pH8.5-9.2
总矿化度/mg • L-13268-4593
上述表中的主要参数表明，原油是聚合物驱采油污水的主要污染物之一，是 污水COD和BOD的主要组成。污水中的原油和COD均已超出外排标准。
1.4聚合物驱含油污水的微生物处理
1.4.1生物修复
按照污水处理的原理可以粗略分类如下[30]:
表1-6污水处理方法 Table 1-6 Sewage treatment method
方法具体分类
物理法重力分离法、粗粒化法、过滤法、膜分离法等
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化学破乳、化学氧化、光氧化等
化学法 物理化学法 生物法
气浮浮选法、吸附法、磁吸附分离法、电化学法等
好氧活性污泥法、接触氧化法、厌氧法、氧化塘法等
从原理上看，处理含油污水的方法较多。各种处理方法都具有实用性和局限 性，在实际污水处理过程中，通常是多种方法结合，使出水达到排放标准。在本 论文中主要探讨生物法在处理含油污水方面的应用。可以将微生物修复定义为： 生物修复是指生物特别是微生物催化降解有机物，修复或消除环境中的污染物的 一个自发或受控进行的过程。国内外研究者对生物修复的一些优点、使用条件及 处理措施进行了归纳 ，如下表1-7。
生物修复的优点
前提条件
基本措施
表1-7生物修复 Table 1-7 Bioremediation
经济实惠
对环境二次污染小 能尽可能降低污染物浓度 原位修复中污染物可就地 清除，操作简便
具有代谢活性的微生物接种高效降解菌
必要的降解速率及去除程度添加营养物质
污染物可被利用，代谢产物没有毒性提供必要的电子受体 污染场地或反应器必须利于微生物生必要时需添加
长和保持活性表面活性剂
14.2微生物对原油的降解
石油污染的修复的基础则是石油烃类化合物的生物降解，其三个必要条件 为：石油烃类的存在、石油烃类降解为生物和适宜的微生物生长的代谢条件。在 环境中能够降解石油烃类的污染物主要有细菌、霉菌和酵母菌等：
表1-8石油烃降解菌
Table 1-8 Petroleum hydrocarbon degrading bacteria
霉菌（Fwsar/wm)
酵母菌假丝酵母属（C^J/_JQ)、红酵母属（仙oJo如owfo)、掷抱酵母属
微生物作为污染修复的载体，不同种类的微生物制约着修复的效率，而原油 组分第变化也会对生物降解产生影响。石油烃类的主要成分是烷烃、芳香烃和环 烷烃。因为结构不同所以各种烃类的降解难易程度也是不同的。原油生物降解的 先后顺序为：烷烃>芳香烃>环烷烃。而没有支链基团的正构烷烃则比异构烷烃 易于被微生物利用。微生物难于降解芳香烃，如苯的生物降解进行较为困难。
石油烃类微生物发生降解，除了具有合适的微生物和石油烃以外，还需要适 宜的微生物和微生物生长代谢的适宜条件，国内外环境工作者从环境因素方面对 采油污水生物降解处理进行了大量的研究，雷云[32]等通过对取自不同地方的污泥 筛选研究试验，得到一株细菌去油率达到83.5%。周东凯[33]从土壤中筛选培养得 到PD-1菌株，该菌株能在常温下及较短时间内高效地降解原油，推广应用的潜 力较高。杨二辉[34]筛选得到一株能在高温条件下对采油污水中的烃类有机物具有 独特降解作用的菌种，他在中试试验中采用生物接触氧化膜法对采油污水进行处 理，在60°C高温条件下，该菌株对含油污水中的石油烃仍具有良好的代谢去除 效果。而Anne Gunn Rike[35]从北极土壤中筛选出的土著嗜油菌，在5〜20 °C低 温条件下仍具有新陈代谢的能力。彭鸽威[36]则从大港油田的石油污染土壤中筛选 出一株高效原油降解菌株X3,研究了该菌株在不同pH和盐度条件下对原油的 降解能力，同时还探讨底物浓度（原油）对细菌生长和降解率的影响，其研究结 果表明该菌株具有一定的耐碱性和耐盐性。陈莉[37]从胜利油田石油污染土壤中分 离得到一株细菌A-1，该菌在盐浓度达到10-20 g • L-1仍对原油中的环烷烃成分 具有降解效果。Rahman[38]则究了 pH值对降解的影响，得到一株耐碱菌，该菌 在pH值8.5时得到最大降解率为43%。Lu M[39]在处理油田采出水时，向其中添 加玉米粉作为营养补充提高了微生物的环境适应能力，从而提高了对原油的降解 效果。混合菌通常相对于单菌具有较好的处理效果，李伟光[40]等筛选得到39株 对原油具有降解能力的细菌，通过研究表明不同菌株混合培养对原油的降解能力 及耐受力明显大于单一菌株，而且全混合菌株的耐受力最强，表明混合菌在降解 原油时具有一定的协同作用，各菌株的共代谢作用提高了全混合菌对环境的适应 力。
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总的来说，影响微生物对原油的生物降解的几个主要因素[30]为:
表1-9生物降解影响因素 Table 1-9 Impact factors of oil biodegradation
因素影响原因
原油物理状态微生物在油水界面上活动，原油分散成都影响油水界面面积 温度温度影响是游艇的物理状态、化学组成和微生物生长及酶活性
营养物质微生物生长代谢需要合适的营养元素比例，原油提供碳源
氧气石油烃生物降解是好氧过程，水体溶解氧制约微生物生长
pH细菌、放线菌事适宜中性或偏碱环境，酵母菌、霉菌适宜偏酸
酸碱度影响微生物代谢及酶活性 盐度对渗透压产生影响，影响细胞质膜的通透性
污染物浓度高浓度污染物对微生物具有毒性，而过低浓度的污染物无法被摄取
1.4.3微生物对聚丙烯酰胺的降解
聚合物驱过程中使用的主要为阴离子聚丙烯酰胺，因为非离子型聚丙烯酰胺 进行水解即可得到阴离子聚丙烯酰胺，所以通常将其称为部分水解聚丙烯酰胺 (HPAM)。对阴离子聚丙烯酰胺具有降解能力的微生物也很多包括古菌、真菌、 细菌和放线菌等。在研究初期，国外研究者对丙烯酰胺单体[41]、丙烯酰胺二聚体 一直到七聚体[42]的生物降解进行了研究，表明细菌能将单体降解为丙烯酸和氨并 最终完全降解，多聚体可以被部分降解。基于对于脂肪族酰胺类的研究 Kay-Shoemake等[43]考察了对阴离子聚丙烯酰胺的微生物降解进行了研究， Kay-Shoemake的实验研究表明，聚合物分子上的氨基易于作为氮源被微生物利 用[44]。
而对于聚丙烯酰胺，它的相对分子量很大而且分子骨架为长碳链结构，对于 微生物降解具有较强抗性，而在驱油中应用时也正需要聚丙烯酰胺分子的稳定 性。在近年来对于聚丙烯酰胺的微生物降解的研究过程中，研究人员曾认为聚丙 烯酰胺分子只能其测量氨基能微生物降解。在后续的研究中筛选到很多能以阴离 子聚丙烯酰胺为碳源的菌株。李宜强[45]、包木太等[46]和刘永建等[47,48]对聚合物 驱污水中的部分水解聚丙烯酰胺(HPAM)进行了降解实验，研究表明HPAM的氨
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基和碳骨架可以被部分降解。
1.4.4PAM的存在对微生物降解原油的影响
虽然目前国内外对于聚丙烯酰胺的生物降解进行了大量研究，特别是在国内 此类研究主要侧重于对于驱油用部分水解聚丙烯酰胺的生物降解，但从总体效果 来说，微生物对于高聚物的降解能力还是有限，聚丙烯酰胺正式由于其具有将强 稳定相才能在地层复杂环境中得以应用。在处理聚合物驱污水时，聚丙烯酰胺和 原油总是同时存在的，也有人筛选得到对原油和HPAM同时具有降解能力的菌 株，在本论文中主要探讨在聚丙烯酰胺存在条件下，微生物对于原油的降解情况。 在前面的章节已经提到，聚丙烯酰胺的存在会使溶液性质发生一系列的变化。微 生物对原油的生物降解是发生在油水界面上的，溶液性质的改变就会影响到原油 的分散状态及微生物的生长代谢从而对降解过程产生影响。
1.5论文研究的目的、内容和拟解决的问题
1.5.1研究目的
通过上述分析可以看出，在聚合物驱含油污水中，原油和PAM是生化处理 的主要对象，聚合物通常比较难以处理，而聚合物的存在增加了污染物的稳定性， 对含油污水的水质性质产生较大影响，而微生物在用于对油田污水的处理的过程 中受到各种因素影响。通过对微生物、聚丙烯酰胺和原油的相互作用，在含聚丙 烯酰胺环境中考察微生物对原油的降解作用。活化实验室高效降解原油菌株，优 化发酵培养条件，在不同水质条件下考察细菌对原油的降解作用；考察原油与聚 丙烯酰胺之间的相互作用；考察在聚丙烯酰胺存在条件下微生物对聚丙烯酰胺的 降解作用；通过发酵罐模拟实验，对含聚丙烯酰胺体系中细菌对原油的降解作用 进行动态跟踪。
1.5.2主要研究内容
(1)聚丙烯酰胺的浓度检测方法及聚丙烯酰胺溶液中原油的回收率
实验过程中使用的是采油用的部分水解聚丙烯酰胺（HPAM)，对污水中
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HPAM的浓度测定有多种方法，实验过程中队几种常用方法进行比较。然后考察 HPAM溶液中原油经石油醚萃取的回收效果，以部分的反映HAPM对原油的作 用。主要考察HAPM溶液粘度变化时原油的回收率变化，通过改变HAPM浓度、 加入无机盐、调节酸碱度、灭菌和机械剪切等途径改变粘度。并对污水中原油浓 度、HPAM浓度的测定方法进行探讨。
(2)高效降解原油菌株的筛选与培养条件优化
将实验室保存的对原油具有降解效果的菌株PM、B-1、D3-2菌株进行活化 培养，另从胜利油田污水中筛选得到三株降解原油的细菌。比较其对原油的降解 效果，并选择合适菌株进行后续降解实验。采用单因素实验方案考察菌株在不同 碳源、氮源、温度、pH值等条件下对原油的降解效果，从而确定细菌降解原油 的最佳培养条件。探讨加入HAPM之后，对微生物生长的影响及对原油降解率的 影响。
(3)发酵罐模拟含聚丙烯酰胺污水中细菌对原油生物降解
利用发酵罐发酵微生物降解含油污水，实时监测在聚丙烯酰胺环境中细菌对 原油的降解过程，对菌浓、发酵液表面张力、溶液粘度、HAPM浓度、pH等因素 进行检测。并最终对各个时期原油组分进行分析。
15.3拟解决的问题
(1)污水中聚丙烯酰胺浓度测测定方法比较，HPAM溶液中原油的回收率
(2)对原油具有降解能力的菌株的筛选
(3)聚丙烯酰胺的存在对细菌生长的影响
(4)聚丙烯酰胺环境中，细菌降解原油的过程动态监测
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2.HPAM浓度的测定方法及HPAM溶液中原油的回收率
2.1前言
从前文可以看出油田聚合物驱污水中含有聚丙烯酰胺（后文所称聚丙烯酰胺 均为部分水解聚丙烯酰胺）等化学助剂。采出液含聚后，污水性质发生了一些变 化，例如：采出水的粘度增加；分散油珠粒径变小；油水界面膜强度增大，界面 电荷增强；采出水中小油珠稳定的存在于水体中；采出液受剪切作用很容易进一 步乳化，油珠之间聚合成大油珠的能力下降。
聚丙烯酰胺从一定程度上导致油水分离困难，增加了含油污水处理的难度。 因此，聚合物驱采出水的达标外排处理工艺，是目前我国油田地面污水处理工艺 研究的热点之一。含聚油田采出水成分复杂，降油微生物生长的环境也趋于复杂。 聚合物驱油污水中的聚丙烯酰胺和原油是实验研究的主要对象。聚合物驱污水中 的聚合物浓度是水质检测的一个重要指标，目前国内外测量聚丙烯酰胺浓度的方 法主要有：淀粉一碘化镉法、浊度法、粘度法、导数紫外光谱法、分子尺寸排阻 色谱法、化学发光定氮法、超滤浓缩薄膜干燥法、氨电极法、荧光分光光度法、 共振散射光谱法、放射性同位素标记法、量热法等等。
本部分讨论了几种常用的HPAM测定方法，对它们的适用性进行了比较。并 通过模拟聚合物驱污水，通过石油醚萃取污水中的原油，来初步探索聚合物乳液 中原油的回收率变化，以期为含聚污水处理提供理论依据。
2.2材料和方法
2.2.1实验材料及试剂
2.2.1.1实验仪器
仪器名称生产厂家
LDZX-50FAS立式电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂
SHA-C水浴恒温振荡器江苏金坛中大仪器厂
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UV-2450紫外分光光度计日本岛津
YS100显微镜日本Nikon
YT-CJ-1ND型洁净工作台北京亚泰科隆实验科技开发中心
78-1磁力加热搅拌器金坛市双捷实验仪器厂
SZ-1快速混匀仪江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂
DHG-9053电热恒温鼓风干燥箱上海山连实验设备有限公司
pH计HANNA Instruments
BL-2200H电子天平曰本岛津
乌氏粘度计(0.-0.6mm)国药集团化学试剂有限公司
乌氏粘度计(0.58mm)上海申立玻璃仪器有限公司
乌氏粘度计(0.73mm)上海申立玻璃仪器有限公司
精密增力电动搅拌器常州国华电器有限公司
2.2.1.2实验试剂
试剂生产厂家纯度规格
NaCl国药化学试剂有限公司AR250g
NaNO3国药化学试剂有限公司AR250g
石油醚国药化学试剂有限公司AR250g
可溶性淀粉天津市天泰精细化工有限公司AR1 kg
碘化镉上海天莲精细化工有限公司AR500 g
溴水国药化学试剂有限公司AR500 g
硫酸铝天津博迪化工有限公司AR500 mL
次氯酸钠天津广成化学试剂有限公司AR500 g
甲酸钠天津市科密殴化学试剂有限公司AR500g
冰醋酸天津广成化学试剂有限公司AR25 g
乙酸钠天津市巴斯夫化工有限公司AR25 g
2.2.1.3原油与聚丙烯酰胺:
原油，来自于胜利油田，将原油脱去不溶的浙青等成分，制备成基准油[51]。 基准油的制备：取一定体积的原油加于干燥的烧杯中，加入与原油体积相等的石 油醚（30-60 °C)将原油溶解，再加入盐酸（体积比1:1)调节pH值为2。使原
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油充分溶解于石油醚中，将溶液静置待其分层。收集上层石油醚萃取液于锥形瓶 中，弃去下层不溶物质。在分离得到的原油的石油醚溶液中加入无水硫酸钠粉末 直至加到不再结块为止，放置2个小时以上使溶液中残余水分基本脱去。用快速 定性滤纸将不溶物滤去，滤液收集于烧瓶中，在旋转蒸发仪上低温蒸馏回收大部 分石油醚，待石油醚蒸发完后，将剩余粘稠的原油液体转移到入干净烧杯中，在 45±1°C的恒温水浴上将其蒸发近干后，放入45±1°C烘箱中烘至恒重，此时剩余 原油即为基准油。将基准油密封保存。
部分水解聚丙烯酰胺（HPAM):水解度<20%，相对分子量>500万，实验过 程中利用乌氏粘度计法测定HPAM的相对分子量。图2-1为HPAM的分子结构。
图2-1 HPAM分子结构 Fig.2-1 The molecular structure of HPAM
聚丙烯酰胺
2.2.2原油浓度测定方法
紫外分光光度法测定原油浓度：用容量瓶配制1000mg_L-1的基准油储备液， 取10只干燥的50 mL具塞的刻度比色管，用吸量管分别加入基准油储备液0.00、
0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00mL，用石油醚稀 释到刻度。此标准系列的浓度分别是0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 和100 mg/L。用紫外分光光度计测出原油溶液在190-400nm之间的最大吸收峰， 然后分别测定各浓度的溶液在最大吸收波长下吸光度，以浓度（mg_L-1)为横坐 标，吸光度为纵坐标，绘制原油浓度(mg_L-1)-吸光度标准曲线。
将含油污水全部转入分液漏斗中，同时用30 mL石油醚分三次洗涤容器， 将石油醚转入分液漏斗中。分液漏斗充分震荡，放气，静置分层，将下层水溶液 放出，收集上层溶液后，用10 mL石油醚洗涤分液漏斗1次，合并上层液[52]， 将原油的石油醚溶液转入1只50mL的比色管中，加入石油醚到刻度线，混合均 匀。用移液管吸取1mL的稀释液转入25 mL比色管中，用石油醚稀释到刻度线，
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混合均匀。用紫外分光光度计在最大吸收波长下测定吸光度，通过原油浓度标准 曲线计算得出原油浓度[53]
2 2 3 HPAM浓度测定方法
本论文讨论了淀粉-碘化镉法、浊度法、粘度法、导数紫外光谱法四种常用 的测量HPAM浓度方法。通过分别绘制标准曲线，比较了四种方法的精密度和 准确度，以及实验的重复性，讨论了方法的应用范围。
取适量HPAM于烘箱中在80°C下烘干12小时，在烧杯中加入1000mL蒸馏 水，将机械搅拌器叶轮置于烧杯中心，开启搅拌调速形成漩涡，称取 0.5000gHPAM，沿着漩涡斜面逐渐加入，搅拌90min，放置过夜后保存于棕色试 剂瓶。同样方法用自来水做溶剂配制1000mLHPAM溶液，另过滤1L含聚丙烯 酰胺的大庆油田污水备用。
2.2.3.1淀粉一碘化镉法[54-57]
(1)将500 mg-L-1聚丙烯酰胺溶液在25mL比色管中，用蒸馏水分别配制成50、 100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚丙烯酰胺溶液；预 先配置好pH=3.5的醋酸缓冲溶液、甲酸钠溶液及淀粉碘化镉溶液。
(2) 在11只50mL的具塞比色管中分别加如5mL pH为3.5的醋酸缓冲溶（其 中含有1个空白作为参比）；
(3)在各比色管中，加入1mL不同浓度梯度的聚丙烯酰胺溶液、然后加入 25-30mL蒸馏水；
(4)加入1mL饱和溴水，混合均匀，进行反应15分钟；
(5)加入5mL甲酸钠溶液，待溶液中的黄色褪去后再混合均匀，反应5分钟， 至颜色完全褪去；
(6)加入5mL淀粉-碘化镉溶液进行显色，并加入蒸馏水至刻度，混合均匀；
(7)静置显色18分钟后，在585nm波长下依次测定溶液的吸光度，用聚合物 溶液浓度为0的比色管作为参比溶液；
(8)用自来水做溶剂，重新测定。测定出大庆水HPAM浓度，并用蒸馏水分别 配制成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶
液测定标准曲线。
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2.2.3.2浊度法[58-61]
(1) 将用用蒸馏水配制好的500 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液于25mL比色管中， 用蒸馏水分别配制成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶液各25mL；预先配制好5mol/L冰醋酸溶液和3.1g/L的次氯酸钠水
溶液。
(2) 加5mL上述配制的聚丙烯酰胺溶液于11个50mL的比色管中（1个空白参 比)；
(3)用移液管加入10mL的冰醋酸溶液，振荡混匀，放置2min;
(4)再加入15mL的次氯酸钠溶液，振荡均匀；
(5)30min之后，使用可见光分光光度计在470nm波长下测定溶液的吸光度， 用蒸馏水做参比，制作吸光度-浓度关系曲线；
(6)用自来水做溶剂，重新测定。测定出大庆水HPAM浓度，并用蒸馏水分别 配制成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶
液测定标准曲线。
2.2.3.3粘度法[62-63]
1.粘度法测定HPAM的相对分子质量：
图2-2乌氏粘度计测定方法
Fig.2-2 Method for viscosity measuring by Ubbelohde viscometer
具体实验操作如下：
(1)使用铬酸洗液将乌氏粘度计洗干净，依次用自来水、蒸馏水冲洗粘度计3-5 次，每次都将毛细管部分反复冲洗，放入烘箱干干燥备用；
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(2)用铁架台固定粘度计悬垂于水浴中，调节高度保证液面没过1球，并使粘 度计上下垂直，在B、C管位置套上乳胶管，方便操作。调节恒温水浴温度为 (30.0±0.1)°C。
(3)用移液管分别移取10mL已知浓度的聚丙烯酰胺溶液和2.5mL的SmohL-1) 的硝酸钠溶液，由A管注入粘度计中，用洗耳球在C管处向内打气，以使粘度 计中的溶液充分混匀，此时聚丙烯酰胺溶液的浓度记为C1，静置10 min恒温之 后测定溶液流出时间。流出时间测定步骤：用夹子封闭C管处乳胶管，用洗耳 球从B管处吸气使溶液慢慢从4球、3球经过毛细管充满2球并上升至1球的 2/3以上位置处封闭B管乳胶管，解去C管的夹子。当放开B管通气后，溶液会 缓慢从毛细管向下回流。聚丙烯酰胺溶液液面流经a刻度时，秒表开始记时，直 至液面降至b刻度时，按停秒表，此时秒表即测得溶液流经a、b刻度送用的时 间，极为溶液的流出时间。重复上述测定过程至少三次，保证三次测得值不超过 0.3 s，三次时间的均值记为t1。
(4)接下来分四次从A管处用移液管移加2.5、2.5、2.5、5.0mL的硝酸钠溶液(浓 度为1mol.L-1)，将溶液进行稀释，使聚丙烯酰胺的浓度依次变为C2、C3、C4、 C5,用（3)中所述的方法测定各个浓度的溶液流的平均流出时间t2、t3、t4、t5。 每次向粘度计中加入了硝酸钠溶液之后，需要充分混匀并抽洗毛细管及1、2球 以保证乌氏粘度计内部各点的浓度一致。
(5)测定溶剂硝酸钠溶液的流出时间。用蒸馏水反复清洗粘度计，反复流洗粘 度计的毛细管部分。实验过程中溶液中的硝酸钠浓度一直为1 mol. L-1，用1 mol- L-1的硝酸钠溶液将粘度计冲洗1〜2次，然后向粘度计中加入约15 mL的硝 酸钠溶液（1 mol.L-1)。测出溶剂的流出时间t0。
2.粘度法测定聚丙烯酰胺浓度 具体实验操作如下：
(1)使用铬酸洗液将乌氏粘度计洗干净，依次用自来水、蒸馏水冲洗粘度计3-5 次，每次都将毛细管部分反复冲洗，放入烘箱干干燥备用；
(2)用铁架台固定粘度计悬垂于水浴中，调节高度保证液面没过1球，并使粘 度计上下垂直，在B、C管位置套上乳胶管，方便操作。调节恒温水浴温度为 (30.0±0.1)°C。
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(3) 将用蒸馏水配制好的500 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液于25mL比色管中，用 蒸馏水分别配制成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶液各25mL；
(4)依次用移液管移取上述各浓度梯度的聚丙烯酰胺溶液15 mL，注入乌氏粘 度计中，用与前面相同的方法测定出各浓度溶液的流出时间t，作出C-t的工作 曲线。
(5)用自来水做溶剂，重新测定。测定出大庆水HPAM浓度，并用蒸馏水分别 配制成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶
液测定工作曲线。
2.2.3.4导数紫外光谱法[64-66]
(1) 将用蒸馏水配制好的500 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液于25mL比色管中，用 蒸馏水分别配制成 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶液；再将上述浓度聚丙烯酰胺溶液稀释10倍于50mL的比色管中， 配制成 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg-L-1 的聚合物溶液。
(2)以蒸馏水为参比，用紫外分光光度计测量上述10个溶液的吸光光度值
(3)选择特定波长求一阶导数，绘制标准曲线。
2.2.4原油与HPAM乳状液的制备及石油回收率的测定方法
部分水解聚丙烯酰胺的存在，会与原油发生乳化，在石油醚萃取原油的过程 中工会形成乳化层，影响测定结果，如果乳化层中的原油不能完全转移到有机层 中会使含油量测定结果偏低，实验过程中考察了聚丙烯酰胺溶液中原油的回收
率。
在250mL锥形瓶中加入100mL的HPAM溶液，在锥形瓶中准确加入一定量 的经石油醚溶解的基准油原油，待石油醚挥发完毕后，振荡锥形瓶，使原有均匀 分散到HPAM溶液中，注意尽量避免将原油沾到瓶壁上。
用石油醚将原油全部萃取，用紫外分光光度计226nm波长下，测定其浓度 为C。在100mL蒸馏水中加入400mg原油，以同样方法处理后测定其浓度为C0。
原油回收率=C/C0
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2.3结果与讨论
2.3.1原油浓度标准曲线
图2-3原油浓度标准曲线 Fig.2-3 Standard curve for oil concentration
通过紫外方法主要测定原油中芳烃组分的变化，可以部分的反应原油经过生 物降解后的浓度变化。经过测定，原油在226nm波长下，具有最大吸收峰，在 此波长下测得的标准曲线为Y=0.0278X+0.0873 (R2=0.9973)，后续实验中主要 通过此公式计算原油浓度。
2.3.2 HPAM浓度测定与相对分子质量 2.3.2.1乌氏粘度计的选择
表2-1乌氏粘度计参数
Table The instrument parameters of Ubbelohde viscomete
毛细管孔径（mm)0.5-0.60.580.73
粘度计常数（mm2/S2)0.0084460.010360.02197
30°C蒸馏水流出时间（S)99.7179.5537.92
100mg.L-1HPAM 相对粘度2.472.122.31
选择0.58mm毛细管乌氏粘度计测定HPAM的相对分子量；由于浓度增大后
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溶液流出时间很长，所以选择0.73mm毛细管测定乌氏粘度计测定粘度曲线，温 度 30°C。
2. 3. 2.2HPAM的相对分子质量
在30C恒温水浴中测定HPAM相对分子质量，毛细管孔径为0.58mm，初始 浓度为1〇〇〇mg • L-1的，测得流出时间，然后计算nsp/C和In nr/C，对聚丙烯 酰胺浓度进行作图，结果如下图：
I |_ I1 I• I1 I• I• I~
0.00.10.20.30.40.50.60.7
1.65 n 1.60¬1.55¬1.50¬1.45¬1.40¬1.35¬S 1.30¬1.25¬1.20¬1.15¬1.10
Concentration of HPAM/g^L-1
图2-4 HPAM相对分子量测定 Fig.2-4 Molecular Weight of HPAM
得到[n]=1.47
根据公式[n]=KMa
30C聚丙烯酰胺的K=37.3X10-6，a=0.66。由此求出粘均分子量M。计算得到其
M=9.184X 106，与所标相对分子量>500万相符。聚丙烯酰胺的相对分子质量越 大，水溶液的粘度越大，油田使用的部分水解聚丙烯酰胺一般都达到几百万，甚 至上千万分子量。
2.3.2.3浓度测定方法选择
2.3.2.3.1淀粉碘化镉法
24
1.6n
水质
R2
蒸馏水 0.9937
自来水
0.9953
污水 0.9950
^OUBqJosqv
2
4
0100200300400500
Concentration of HPAM/g^L-1
图2-5淀粉碘化镉法 Fig.2-5 Starch cadmium iodide method
如上图，在用淀粉碘化镉法测定HPAM的浓度时，在以蒸馏水、自来水为 溶剂或者以污水为底物所的到的标准曲线的线型基本没有差别，R2都在0.99以 上，线性较为良好。
Fig.2-6 Turbidimetric method
2.3.2.3.2浊度法
图2-6浊度法
如上图，在用浊度法测定HPAM的浓度时，在以蒸馏水、自来水为溶剂时
25
的到标准曲线基本一致且R2都在0.99以上。但污水为底物进行测定时，线性不 好，说明浊度法在测定污水中HPAM浓度时，容易受到干扰因素影响，误差较 大。
2.3.2.3.3粘度法
800¬600- E P
X
400- fc
山
200¬50100150200250300350
Concentration of HPAM
图2-7粘度法 Fig.2-7 Viscometric method
在用蒸馏水配制的HPAM溶液中，随着HPAM浓度的增大，其相对粘度呈 指数增长，而非线性增长。由于污水中存在大量无机盐离子或其它物质，对溶液 粘度影响很大，用粘度法只能测定纯HPAM溶液的浓度，无法应用于污水水质 测定。
2.3.2.3.4导数紫外法
26
^OUBqJosqv
^OUBqJosqv
0100200300400500
Concentration of HPAM
图2-8 HPAM紫外光谱 Fig.2-8 UV spectra of HPAM
图2-9导数紫外光谱法 Fig.2-9 Method of UV spectra
203A217A217D
R20.95840.95890.9827
当使用自来水配制聚丙烯酰胺溶液或用测定污水时，溶液在190-300nm范围 内具有很强的吸收，聚丙烯酰胺吸收峰被掩盖无法测定，本方法中只使用蒸馏水 配制聚丙烯酰胺溶液进行了测定。
27
部分水解聚丙烯酰胺水溶液在203nm处具有最大吸收峰，在最大吸收峰处, 绘制吸光度与浓度直线，R2=0.9584没有较好的线性相关性。在217nm处，吸收 曲线一阶导数值具有极值，通过217nm处的吸光度对浓度绘制直线，或绘制一 阶导数值-浓度直线，R2分别为0.9589和0.9827,有所提高，但线性相关性仍然 较差。实验表明导数紫外光谱法测定聚丙烯酰胺浓度的方法适用性并不是太好， 而且由于聚合物驱污水成分复杂，很多成分都有紫外吸收，对测定干扰大，这种 方法只在测定聚丙烯酰胺纯溶液时具有一定应用。
通过比较，相较于其它几种方法，淀粉碘化镉法测定方法比较繁琐，但是其 在测定聚丙烯酰胺浓度的过程中，受到干扰影响小，特别是在测定污水中聚丙烯 酰胺时仍具有很好的准确度，选择淀粉碘化镉法作为后续实验中测定溶液中 HPAM浓度的方法。
2.4HPAM与原油之间的作用
2. 4.1盐效应对HPAM溶液相对粘度的作用
乌氏粘度计中，使NaCl浓度维持在2g • L-1或NaN〇3保持在1mol • L-1浓
度，不断稀释HPAM溶液使其浓度降低，测定不同浓度下的相对粘度值。得到 如图结果。对数据进行指数增长拟合。
-1000100 200 300 400 500 600 700
HPAM浓度C/mg.L—1
NaCl 0.99996 NaNO3 0.99998
图2-10盐效应对HPAM相对粘度的影响
Fig.2-10 The relative viscosity of HPAM under different concentration of NaCl
28
水体中的Ca2+、Mg2+、Na+、K+等无机盐离子通过屏蔽效应、降低HPAM分 子氢键等作用，使HPAM长链分子内或分子间的作用力降低，从而使溶液的粘 度减小。聚丙烯酰胺体系中原油的生物降解作用研究，在Na+作用下，HPAM溶液的相对粘度随浓度增大呈现指数增长，两条 曲线拟合R2都在4个9以上。
2. 4.2不同浓度的HPAM相对粘度和原油回收率的关系
在10只洁净的锥形瓶中分别加入100ml的100,200,300,400,500,600, 700，800，900，1000mg-L-1的HPAM溶液，在另一只锥形瓶中加入100ml蒸馏
10-
0
%/#咨回思晒
o o o o o
9 8 7 6 5
200400600
HPAM浓度C/g ‘
800
1000
1-40
30
0
水作为对照，测定溶液的相对粘度，然后在各锥形瓶中加入原油40mg,振汤乳 化后将锥形瓶中的原油全部萃取计算原油回收率。测定结果如图：
图2-11不同浓度HPAM溶液中原油的回收率 Fig.2-11 The recovery rate of oil in HPAM solution
随着聚丙烯酰胺浓度增大，溶液的相对粘度呈指数增长（指数拟合 R2=0.9997)，而原油的回收率则逐渐降低，相对于HPAM浓度具有一定的线性相 关性（线性拟合R2=0.9803)。
2.4.3不同浓度NaCl作用下HPAM的相对粘度及对原油回收率的影口向
在6个250mL锥形瓶中各加入200mg.L-1的HPAM溶液100mL，分别加入 NaCl使溶液中NaCl浓度为0, 2, 4, 6, 8, 10g-L-1，测定溶液的相对粘度，然
29
后加入原油40mg，测定原油回收率。另在6个250mL锥形瓶中加入100mL的 NaCl溶液，浓度分别为为0, 2, 4, 6, 8, lOg.L-1，加入原油40mg测定回收率。
-110
-100
%/#咨回思晒
50
60
测的结果如图：
NaCl浓度C/g*L-1
图2-12不同浓度NaCl下HPAM相对粘度及原油回收率变化 Fig.2-12 The recovery rate of oil in HPAM solution with different concentration of NaCl
%/#姿回
100.
在加入NaCl后，HPAM溶液的相对粘度迅速降低，随着NaCl浓度的继续 增大，相对粘度变化则趋于缓慢，在NaCl浓度为6g • L-1溶液相对于蒸馏水的 相对粘度仅为1.46，原油回收率到达95°%以上。
50
0246810
NaCl浓度C/g.L-1
图2-13 NaCl的存在对原油回收率的影响 Fig.2-13 The recovery rate of oil in NaCl solution 在单纯NaCl作用下，溶液与水溶液基本没有区别，对原油回收率影响不大。
30
2.4.4pH对HPAM的相对粘度及原油回收率的影响
在7只250ml的锥形瓶中各加入100mL浓度为200mg • L-1的HPAM溶液，
另一只锥形瓶中加入100mL蒸馏水作为空白，用稀盐酸和NaOH溶液调节前7 只锥形瓶中溶液pH为2,4,6，7,8，10，12后测定相对粘度，然后分别加入 原油40mg,振荡乳化后，测定原油回收率。
「100
6-
"
-90
I _
4 2
050
24681012
pH
nr % ^ ▲
%/#每回思M o o
8 7
图2-14 pH对相对粘度及原油回收率的影响 Fig 2-14 The recovery rate of oil and relative viscosity of HPAM under different pH
水解引入的阴离子基团间的静电排斥作用使聚合物链更加扩张，因此，随 HPAM水解程度的增加，HPAM溶液粘度会持续增加[67]。200mg • L-1的HPAM 溶液的初始pH约为7。随着pH的升高或降低溶液的相对粘度都会减小，原油 回收率则相应提高。pH升高会促进HPAM的水解，降低pH则抑制HPAM的溶 解性，在调节pH的过程中随着Na +或Cl-的加入，HPAM的粘度也会随之降低。
2. 4.5原油浓度
在5个锥形瓶中分别加入200mg • L-1的HPAM溶液100mL,然后加入原油 50, 100, 200, 300, 400mg,振荡成乳状液后，将原油全部萃取，相对于空白
计算原油回收率。
31
图2-15不同浓度原油的回收率
Fig.2-15 The recovery rate of oil under different concentration of oil
溶液中存在溶解态和乳化状的原油，由图可已看出，随着原油浓度的增大， 原油回收率有所下降，但下降幅度较小。
2.4.6灭菌及摇床振荡对HPAM溶液相对粘度的影响
在高压灭菌条件下，或在摇床生物培养机械振荡作用下，聚丙烯酰胺体系中原油的生物降解作用研究，HPAM相对粘度会 有变化，在实验过程对其变化进行了测定。在500ml的锥形瓶中加入200mg *L-1 的聚丙烯酰胺溶液200mL，封住瓶口，在121°C的灭菌锅中灭菌20min。用淀粉 碘化镉法测定灭菌前后溶液浓度。将锥形瓶放入摇床中转速为120r* min-1振荡， 测定其粘度变化。
Time/d
图2-15 HPAM溶液相对粘度变化 Fig.2-15 The relative viscosity of HPAM 32
在灭菌前后测得溶液的浓度为197.4mg.L_1和202.4mg-1，溶液浓度基本不变，
而相对粘度则在灭菌后大幅降低，通过7天的振荡，溶液相对粘度略微降低但变 化不大，相对粘度在2.1以上。HPAM溶液经灭菌，或溶液中添加有无机盐后， 溶液粘度会显著下降，原油与HPAM形成的乳状液经石油醚萃取后回收率也较
高。
2. 5本章小结
本章对HPAM的部分性质进行了测定，比较了几种常用的HPAM浓度测定 方法的适用性，并探讨了部分因素对HPAM溶液相对粘度的影响，及对HPAM 与原油乳状液中原油萃取的回收率变化，得到如下结论：
(1)对本论文所用到的聚丙烯酰胺的分子量进行了测量。计算得到聚丙烯 酰胺浓度的粘均分子摩尔质量M=9.184x106。
(2 )淀粉碘化镉法能够更好的适用于测定复杂水质中的HPAM浓度。
(3)HPAM水溶液相对粘度相对于其浓度呈指数增长，在单一盐效应作用 下，仍保持指数增长模式。
(4)在HPAM与原油形成的乳状液中，当通过调节pH、投加无机盐、灭 菌、机械剪切等手段使HPAM溶液粘度降低时，原油回收率则相应提高。
33
3.原油的生物降解
3.1前言
油田污水组成复杂，依据油田的生产、环境因素等可以进行回注或外排。回 注到地层和外排至环境中都需要将水体中的原油含量、悬浮物质等各项指标进行 严格控制，不能对地层系统或者生态环境造成伤害。而由于油田生产或者事故等 原因造成的水体污染，也需要对其进行修复。本论文中主要讨论用微生物对含油 污水进行生化处理的室内研究。
在对含油污水进行生化处理时需要合适的菌株及环境条件。在油田污水中生 长有大量的物种丰富的微生物，通过一定的手段可以筛选出对原油具有较高降解 效果的菌株。微生物对原油进行降解时，pH、温度、氧浓度等环境条件对降解 效果产生一定的影响，而聚合物驱污水中存在的聚丙烯酰胺，对原油的状态及溶 液性质产生影响，从而也会对微生物生长代谢原油产生影响。为了对油田污水进 行有效地生化处理，实验室前期筛选得到几株降解原油的细菌，实验过程中对保 存的菌种进行了活化，比较了其对原油的降解能力。本章的主要内容是从胜利油 田污水中筛选得到能降解高浓度原油的细菌，对其进行了生理生化鉴定，并考察 了在HPAM存在条件下细菌降解原油的影响。
3.2材料和方法
3.2.1实验材料和试剂 3.2.1.1实验仪器
日本岛津
上海山连实验设备有限公司
DHG-9053电热恒温鼓风干燥箱
UV-2450紫外分光光度计
江苏金坛中大仪器厂
SHA-C水浴恒温振荡器
生产厂家
上海申安医疗器械厂
上海亚荣生化仪器厂
RE-52AA旋转蒸发器
LDZX-50FAS立式电热压力蒸汽灭菌器
78-1磁力加热搅拌器 SHP-150生化培养箱 pH计
YT-CJ-IND洁净工作台金坛市双捷实验仪器厂 上海山连 HANNA 北京亚泰科隆
3.2.1.2实验试剂
试剂生产厂家纯度规格
_4)2S〇4天津市迪博化工试剂有限公司AR500 g
MgS〇4.7H2〇天津市巴斯夫化工有限公司AR500 g
KH2PO4天津市天大化工实验厂AR500 g
K2HPO4.3H2O天津市博迪化工有限公司AR500 g
无水氯化钙天津市科密殴化学试剂有限公司AR500 g
MnS〇4*H2〇天津市瑞金特化学品有限公司AR500 g
ZnS〇4*7H2〇天津市天大化工实验厂AR500 g
FeS〇4*7H2〇天津市耀华化学试剂有限公司AR500 g
无水硫酸钠天津市北方天医化学试剂厂AR500g
石油醚30-60°C天津市博迪化工有限公司AR500 mL
NaCl天津市巴斯夫化工有限公司AR500 g
琼脂北京双旋微生物培养基制品厂AR1 Kg
3.2.2菌种的比较与筛选 3.2.2.1原有菌株的活化与培养
实验室保藏菌株PM，B-1，D3-2对原油具有一定的降解效果，通过分别活 化，比较其降解原油的能力。
35
富集培养基：牛肉膏3 g.L-1，蛋白胨10 g.L-1，NaCl 5 g.L-1，（琼脂）pH=7
微量元素：ZnS〇4-7H2〇 0.3 g-L—1，FeS〇4-7H2〇 0.5 g-L—1，CaCb 0.2 g-L—1， MnS〇4-H2〇 0.06 g-L'1。
无机盐培养基：
(1) PM: HPAM 0 3 g-L'1，NaN〇3 0 3 g-L'1，MgS〇4 0 3 g-L'1，KH2PO4 0 5 g-L'1， K2HPO4 0.5 g-L'1，原油 0.2 g-L'1，微量元素 10mL/L，pH=7
(2) 3.1： NaCl 5 g-L'1，MgS〇4 0.5g-L'1，K2HPO4 3.0g-L'1，NaH2P〇4 3g-L'1， CaCb Q^g-L'1，原油 Ig-L'1，pH 7-7.5
(3) D3'2： NaCl 2 g-L'1，MgS〇4'7H2〇 0.7g-L'1，KH2PO4 3.0g-L'1，Na2HP〇4 Ug-L'1，CaCl2 0.1g-L'1，酵母粉 ^心1，原油，pH 7
3.2.3筛选菌株
3.2.3.1菌种来源
油田环境中生存有大量微生物，部分以原油作为碳源生存，菌种筛选自胜利 油田污水。
3.2.3.2选择培养基
NaCl 2 g-L'1，MgSO4-7H2O 0.7g-L'1，KH2PO4 3.0g-L'1，Na2HPO4 1.5g-L'1， CaCb 0.1g-L'1，酵母粉 1g-L'1，石蜡，pH〜7
(1)驯化：取油田污水接种到装有富集培养基的锥形瓶中，放入摇床培养2天 后，转接到选择培养基中，放入摇床培养3天，温度30°C、转速120r* min'1， 设定选择性培养基中石蜡浓度依次降低，原油浓度逐渐升高。最后得到驯化成熟 后的菌液。
(2)分离纯化：从驯化成熟的选择性培养基中抽取菌液，多次转接后，进行涂 布及划线分离。取菌液在固体基础培养基平板上涂布分离，得到单个菌落，挑取 不同的单个菌落，分别接种于液体选择培养基中进行驯化培养，反复涂布分离， 得到纯化的菌落。将纯化后的菌落进行转接，通过划线培养，多次转接之后，用 显微镜进行检测，以保证充分分离纯化，没有混合杂菌，菌种的筛选完成。
(3)菌种保藏：将分离得到的菌种转接到斜面培养基上，放入生化培养箱，培 养约2d，观察菌落生长，然后将培养基试管包好存入4C冰箱，斜面培养基能进
36
行短期保存。长期保存则将甘油管和甘油分别灭菌后，在甘油管中加入适量的甘 油，挑取菌落悬浮于甘油中，将甘油管冷藏于-80°C的超低温冰柜中。
3.2.4细菌的生理生化鉴定
细菌的生化鉴定主要依照《常见细菌系统鉴定手册》[67]、《简明第八版伯杰 细菌鉴定手册》[68]以及《微生物学实验》[69]进行，主要对细菌的基本性质及形 态进行初步的鉴定。本次实验主要进行了以下生化鉴定包括：V-P、甲基红、接 触酶和革兰氏染色实验等。
(1)革兰氏染色：挑取一环生长成熟的菌体，将其均匀涂在、洁净的净的玻 片上的固定位置，滴加一滴无菌水将菌体稀释分散开然后风干固定。然后滴加结 晶紫混合液染1-2 min后，用蒸馏水洗去。接着滴加碘液，lmin之后用蒸馏水洗 去，再吸干水分。用95%乙醇溶液进行脱色，蒸馏水洗至无色之后滴加沙黄复染 液进行染色2min，使用蒸馏水冲洗后风干固定。完毕之后在油镜下观察细胞的 颜色。深紫色为革兰氏阳性细菌，红色为革兰氏阴性细菌。
(2)接触酶实验
将细菌接种到基础培养基平板上培养24h，使用接种环挑取适量菌体涂到已 滴加有过氧化氢溶液（3%)的载玻片上，如果有气泡产生则为阳性，没有产生 气泡为阴性。
(3)甲基红实验
培养基配方：蛋白胨：5g/L;葡萄糖：5g/L; K2HPO4: 5g/L; pH=7.0-7.2。
将培养基分装于小试管中灭菌；配制甲基红试剂。将筛选的菌种，接种到试管中， 放置到30C的生化培养箱中培养2、6d;将试管取出，在菌液中滴加甲基红进行 显色反应，菌液显红色则为阳性，显黄色则为阴性。
(4)V-P实验
V-P培养基配方与甲基红试验中使用的相同，灭菌及接种方式也相同，预先 配制氢氧化钠溶液（40%)和肌酸溶液。接菌之后，30°C生化培养箱中培养2天 和6天，取培养的菌液与氢氧化钠按体积比1:1混合均匀，再加几滴肌酸溶液， 10分钟（有时需放置较长时间）后如过菌液显现红色，则为阳性反应。
37
生长繁殖是细菌的重要生命活动，而细菌在环境中生长繁殖也是有生命周期 的，生长曲线的测定就是为了反映细菌生长繁殖的过程。在细菌生长繁殖的过程 中，聚丙烯酰胺体系中原油的生物降解作用研究，生长速率会有变化，通常根据生长速率的不同将其生长曲线分为四个时期， 包括：延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。当细菌接种到培养基中后需要适应环 境之后开始繁殖，这段适应时间极为延滞期，之后细菌生长进入对数期，细菌数 量呈对数增长，当细菌数量达到环境条件的极限时，在细菌大量繁殖的同时也会 有部分细菌死亡，细菌总量趋于稳定，稳定期之后营养物质逐渐消耗完，细菌数 量逐渐减少进入衰亡期。
实验中，将细菌接种到培养基中之后，随着细菌的大量繁殖，培养基会变得 越来越浑浊，而通过测定溶液的浊度可以反映细菌菌体的浓度。本实验中分别将 筛选的细菌单独和全混合菌接种到富集培养基中，以不接菌的培养基为空白对 照，在可见光分光广度计600nm波长下测定培养接的浊度变化，连续测定14个 小时，然后绘制浊度OD对时间的曲线，即得到细菌的生长曲线。
3.2.6优势菌株的筛选及降解条件的优化
菌株组合筛选：将筛选得到的细菌接种到选择培养基，进行组合培养，按表 3-2的接种量进行，总接种量为3%，在30°C的恒温水浴振荡器中培养5天之后 测定原油降解率。
3.2.6.1 pH值对细菌降解原油的影响
在选择培养基中加入NaCl浓度为2 g/L，原油质量浓度为3 g /L，分别调节 培养基的pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、和9.0，接种量3%。在恒温摇床上培养 5d测定原油降解率，培养温度为30°C，转速120 r/m in 3.2.6.2NaCl质量浓度对细菌降解原油的影响
培养基中原油质量浓度为3 g/L，NaCl的质量浓度分别为0、1、2、3、4、
5、10和15 g/L。培养温度30C，摇床转速120 r/min，培养5d，一不接菌的为 空白，测定原油降解率。
3.2.6.3不同温度下细菌对原油的降解效果
培养基NaCl浓度为2g /L，原油质量浓度为3g /L，设置培养温度分别为4、
38
18、25、30、35和50°C，120 r/m in的条件下载摇床中培养5 d,相对室温下不
接菌空白，测定原油降解率。
3.3结果与讨论
3.3.1已有菌株对原油的降解能力
PM系列：当原油浓度为0.1g.L-1时，降解率达到70%以上，但随着原油浓 度增大降解率则随之降低。当原油浓度为3g*L-1时，PM，B-1，D3-2对原油的降 解率都在20%以下
图3-1原油浓度对原油降解率影响 Fig.3-1Degradation rate under different crude oil concentration
Bacteriums
图3-2三株细菌对原油的降解能力 Fig.3-2 Degradation rate of different bacteriums
39
因此重新进行了细菌筛选，已期得到较好的降解效果。 3.3.2菌株筛选结果
经过筛选分离得到三株好氧细菌。暂将其命名为W-1，W-2, Y-1。菌株革 兰氏染色照片为
W-1W-2Y-1
图3-3革兰氏染色照片 Fig.3-3 Photos of Gram stain
表3-1为三株细菌的形态及部分生理生化鉴定结果
表3-1细菌的生理生化特征 Table 3-1 The physiological and biochemical property
测试项目W-1W-2Y-1
细菌形状杆菌短杆杆菌
菌落颜色白色乳白黄色
透明度不透明不透明半透明
革兰氏染色+++
接触酶+++
甲基红+--
V-P测定+--
40
图3-4细菌的生长曲线 Fig.3-4 Bacterial growth curve
将三株细菌W-1, W-2和Y-1分别以及三株细菌等量混合以3%的比例接入 到富集培养基中，以不接菌的培养基溶液为空白对照，测得的OD-时间曲线。， 从3-4图中可以看出，在0-3h内处于延滞期，三株单菌及混合菌生长较为缓慢。 之后细菌OD值迅速增加，细菌大量繁殖进入对数增长期。经过5个小时的对数 增长之后，菌液OD增长幅度明显放缓，三株细菌进入稳定期的时间基本形同。 在8-13h之间，OD值略微增加。由于菌体死亡之后，菌液仍然浑浊不会变清， 浊度法在判断细菌生长的衰亡期具有一定困难。其中菌株W-1与W-2的生长较 快，菌液浊度较大，而Y-1则相对浊度较小，可能因为Y-1菌落为半透明黄色， 其菌液吸光度会较另两株菌小。
3.3.4细菌对原油的降解能力
在实验过程中选育优势组合菌株，进行降解实验。在8只250mL的锥形平 中分别加入选恶性培养基100mL，灭菌后后按如下表比例进行接种，接种总量 为3% (体积比）。在120rmin-1，30°C的摇床中培养5天，以不接菌的锥形瓶为 对照，测定原油降解率。
41
Table 3-2 Inoculum size of combined cultivation
序号对照1234567
W-103001.51.501
W-200301.501.51
Y-1000301.51.51
(％)嫌遨盤
菌组
图3-5菌株组合降解效果 Fig.3-5 The degradation effects of composite strains
单株细菌的降解能力不到20%，除了第6组，组合菌的降解能力均有所提高， 而仍然以三株细菌组合的菌组对原油具有较好的降解能力。后续实验中选择W-1， W-2，Y-1的混合菌液作为菌种进行原油降解实验。
3.3.5部分营养的改变对细菌生长及原油降解的影响
实验过程中比较了部分营养元素的变化对细菌生长及原油降解的影响。其中 比较了酵母粉与NaN〇3共同作为N源或作为唯一 N源的影响。在细菌筛选过程 中，添加的少量石蜡有助于细菌的生长，因此比较了在是否添加石蜡的情况下， 细菌对原油的降解效果。另选择(NH4)2HP〇4与NH4H2PO4作为N源和P源，t匕 较其相对于其它培养基是否具有优势。
42
买验分组如下表，表中宫养物质单位为g/L, 6只250mL锥形瓶中按表添加 培养100mL,灭菌后接菌量为5%,空白对照不接菌，在120rmin-1，30°C的摇
床中培养5天，测定菌浓及原油降解率。
表3-3培养基配方
Table 3-3 Medium
123456(空白）
NaCl222222
MgS〇4 • 7H2〇0.70.70.70.70.70.7
KH2PO43.03.03.03.0-3.0
N2HPO41.51.51.51.5-1.5
CaCl20.10.10.10.10.10.1
原油333333
酵母粉0.50.25-0.50.50.5
NaNO3-0.350.5---
_4)2HP〇4----3-
NH4H2PO4----3-
液体石蜡---0.2--
ndo60_l
4 18 5 2 2 11
%/(D10y u 〇 !lep(oJ 69Q
D菌浓 D降解率
图3-6不同培养基中菌浓及原油降解率 Fig.3-6 The degradation rate of oil and bacterial concentration in different mediums
43
通过1，2, 3组的比较可以发现，酵母粉作为唯一 N源时，细菌生长量及
对原油的降解效果，高于以藤 N源，可能是因为酵母粉作) 促进细菌生长的部分氨基酸。 培养基中菌浓有所提高，但对 但同时作为C源与原油产生j 菌浓和原油降解率均为最低。
因此后续实验中选择培养 KH2PO4 3.0g-L-1, Na2HP〇4 1.
3.3.6组合菌株在不同环境条
^母粉、NaNO3混合N源，或者以NaNO3作为唯一 ^有机N源更容易被细菌利用，而且酵母粉中含有 通过1，4组的比较，发现添加少量石蜡的情况下， 原油的降解效果则降低了，石蜡促进了细菌的生长， 笔争。（NH4)2HP〇4与NH4H2PO4作为N源和P源，
声基配方为：NaCl 2 g-L-1，MgS〇4-7H2〇 0.7g-L-1， 5g-L-1，CaCl2 0.1g.L-1，酵母粉 1g-L-1，pH 7。
^件下对原油的降解能力测试
'原油降解效果
3.3.6.1不同pH条件下细菌对
0/0/CDley uolle!DeJ69cl
5 0 2 2
—1 5
高或过低都影响降解率，在pH=7.0时细菌对原油的
6789
pH
图
Fig.3-7 ]
3.3.6.2不同盐度条件下细菌对 从图3-8可以看到随着盐
3-7 pH对原油降解率的影响 Degradation rate under different pH
t原油降解能力
^度的增大该菌组对原油的降解率先增大后减小，聚丙烯酰胺体系中原油的生物降解作用研究，不 该菌株组合对高盐度具有一定的耐受性，而当NaCl 为3g.L-1时降解效果最佳。
44
NaCl/g-L-1
图3-8盐度对原油降解率影响 Fig.3-8 Degradation rate under different salt content(NaCl)
3.3.6.3不同温度下菌组对原油降解效果
图中的数据显示细菌在30-35°C时生长最好，降解效果效果最佳。当温度很 低时，细菌对原油几乎没有降解效果。温度上升，使细菌的酶活性加强，细菌的 降解能力相应增强，而当温度继续上升时，酶活性则下降，降解能力降低。
图3-9温度对原油降解率影响
Fig.3-9 Degradation rate under different cultivation temperature
45
3.3.7原油降解效果 3.3.7.1优化条件下细菌对原油的降解效果
通过对营养元素的选择，及环境条件的优化。选择在优化的条件下进行后续 的实验，培养基配方为：NaCl 3g-L-1，MgS〇4-7H2〇 0.7g-L-1，KH2PO4 3.0g-L-1， Na2HP〇4 1.5g-L-1，CaCb 0.1g-L-1，酵母粉 1g-L-1，pH 7。培养条件为：温度 35 。。，pH〜7。
在此条件下培养5天测定了原油降解率为31.4%。这个降解效果，相对于其 它降解石油烃的高效菌株来说，降解效率仍然偏低。
3.3.7.2不同聚丙烯酰胺浓度下细菌对原油的降解作用
预先配置1000mg*L-1的HPAM溶液备用。在250mL的锥形瓶中加入含聚丙 烯酰胺的培养基100mL，使培养基中的聚丙烯酰胺浓度分别为：0, 200, 400, 600, 800, 1000mg.L-1，灭菌后进行接种培养，将混合菌液按总量5%的比例接 入培养基中，另6只锥形瓶加入同样的培养基灭菌后作为对照，在35°C，120rmin-1 的摇床上培养一周，测定原油降解率。得到如下结果：
05050505 4 3 3 2 2 1 1
%/0rocc:uolropeJ60Q
02004006008001000
Concentration of HPAM/mg •L-1
图3-10不同浓度HPAM条件下原油降解率 Fig.3-10 The degradation rate of oil in HPAM solution with different concentration 加入HPAM后，原油降解率在30%-40%，随着HPAM浓度增加，细菌对原
油的降解率略有增加。经灭菌之后，溶液的粘度降低很多，而且因为培养基中大
46
量无机盐离子的存在，可以认为原油的回收率很高，受HPAM浓度影响不大。
在500mL的锥形瓶中加入选择培养基200mL，使HPAM浓度分别为0，0, 500mg-L-1，分别编号为：空白，1，2。空白不接菌，1、2号接菌，在35°C，120rmin-1
的摇床上培养一周，实验过程中比较细菌生长。并测定最后的降解率。
在实验过程中发现，所筛选的得到的细菌还具有絮凝效果。如下图中照片： 摇床培养7天后静置一段时间，液面浮油都絮凝沉降至瓶底，且溶液变得相对澄 清，而空白对照瓶原油大多浮在液面或悬浮于溶液中。含有500mg.L-1的HPAM 的锥形瓶中，絮凝沉降得更加彻底。
空白对照12
图3-11原油降解效果 Fig.3-11 Crude oil degradation effects
实验过程中，每天观察溶液乳化状况，2号锥形瓶，经过第一天的培养后原 油与溶液混合较为均匀，没有大块浮油，比1号瓶提前。
图3-12 HPAM对细菌生长的影响
Fig.3-12 The effect of HPAM on growth of bacteria
47
测定了第2到第7天的菌浓得到结果如下：
在初期，菌浓几乎相同，在第2天和第三天，培养基中菌浓都维持在108-109 数量级。从第四天溶液中菌浓开始下降，而到第一周时，含HPAM的溶液中， 细菌则维持着较高菌浓接近108,比不添加HPAM的培养基中高出一个数量左右， 这可能是因为一方面HPAM的存在使溶液中溶解态和悬浮状的的原油增多，增 大了油水界面面积，利于原油被细菌作为营养利用，另一方面HPAM能提供一 小部分的N源。
含500ng*L-1的培养基经灭菌，而且溶液中含有大量无机盐，溶液的相对年 度降低，原油回收率在94%以上。1, 2号锥形瓶测得原油降解率分别为30.71% 和39.12%。添加HPAM后原油降解率略有提高。
3.4本章小结
本章主要比较并筛选出降解原油的优势细菌，并对其降解能力进行了优化与 测定：
(1)筛选出3株对原油具有一定降解效果的细菌并定性考察了 3株细菌的 生理生化性质。
(2)通过构建优势混合菌，并优化出细菌降解原油的环境条件为：pH =7, 最佳盐度为NaCl=3g.L-1，温度35°C。
(3)初步探索了添加HPAM对细菌生长及对原油降解效果的影响。添加 HPAM后，对细菌具有一定促进能力，原油降解率略有提高。
48
4.HPAM存在条件下细菌对原油的降解作用
4.1前言
前期筛选的到三株对原油具有降解和絮凝效果的细菌，在实验过程中主要使 用锥形瓶在恒温水浴振荡器上进行摇瓶实验，发酵液体积较小，溶解氧等因素不 易控制。本章中通过10L的发酵罐，进行扩大培养，通过控制搅拌和曝气等手段 精确控制和监测发酵过程，模拟在HPAM环境下细菌对原油的降解作用，并对 发酵过程进行全程监测。对发酵过程中的细菌生长过程、溶液粘度、表面张力、 HPAM浓度、原油组分等参进行测定。通过GC-MS对发酵过程中原油烃组分的 变化进行检测。
4.2材料和方法
4.2.1实验材料和试剂
4.2.1.1实验仪器
上海申安医疗器械厂 上海保兴
江苏金坛中大仪器厂 日本岛津 曰本岛津
北京亚泰科隆实验科技开发中心 金坛市双捷实验仪器厂 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂 上海山连实验设备有限公司 HANNA Instruments 日本Nikon 上海衡平仪器仪表厂
LDZX-50FAS立式电热压力蒸汽灭菌器
发酵罐
SHA-C水浴恒温振荡器 UV-2450紫外分光光度计 BL-2200H电子天平 YT-CJ-1ND型洁净工作台
78-1磁力加热搅拌器 SZ-1快速混匀仪 DHG-9053电热恒温鼓风干燥箱 pH计
YS100显微镜 BZY-2表面张力仪
仪器名称生产厂家
JZ200A界面张力仪
血球计数板 精密增力电动搅拌器 气相色谱仪 气相色谱/质谱联用仪承德市精密试验机有限公司
常州国华电器有限公司 岛津 GC-2010 岛津 GC-2010
4.2.1.2实验试剂
试剂生产厂家纯度规格
NaCl天津市博迪化工有限公司AR250g
NaN〇3天津市博迪化工有限公司AR250g
石油醚国药化学试剂有限公司AR250g
可溶性淀粉 天津市天泰精细化工有限公司AR1 kg
碘化镉上海天莲精细化工有限公司AR500 g
溴水国药化学试剂有限公司AR500 g
次氯酸钠天津广成化学试剂有限公司AR500 g
甲酸钠天津市科密殴化学试剂有限公司AR500g
冰醋酸天津广成化学试剂有限公司AR500ml
正己烷天津市巴斯夫化工有限公司AR500ml
正己烷天津市巴斯夫化工有限公司色谱纯500g
内标西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司色谱纯-
4.3发酵罐发酵试验
4.3.1培养基及发酵条件 4.3.1.1培养基
营养物质g/L5L 量/g
NaCl315
MgS〇4-7H2〇0.73.5
KH2PO43.015
Na2HPO41.54.5
无水CaCb0.10.5
酵母粉110
原油325.47
50
HPAM〇.525
微量兀素液，1mL/L，121 °C灭菌20 min。
实验过程中发酵培养基为5L，为防止原油大量粘附罐壁或搅拌叶轮上，保 证可有效利用的原油的量，在发酵罐中加大了原油的量。
4.3.1.2发酵条件
发酵条件参数
温度35。。
盐度NaCl 3g/L
pH7.0
曝气0.1-0.3 L/min
转速100-200 rpm
4.3.2采样与数据测定 4.3.2.1 采样
101mL50mL5mL10mL100mL
2
351505
49150510100
5241505
630150510100
7351505
848150510100
972150510100
1096150510100
11120150510100
12144150510100
13168150510100
14停
PH电极自动测定记录 溶解氧探头自动测定记录
采样 时间 菌浓表面 HPAM 溶液石油烃溶解氧pH 序号（小时）张力 浓度 粘度
每次米样lOOmL，抽取1mL用于测定囷浓。然后将溶液用正己烧卒取，有 机相用于测定原油烃组分，水相经过滤后，用于测定HPAM浓度、溶液表面张 力、溶液粘度等指标。发酵过程中的溶解氧及pH变化由探头直接测定。
4.3.2.2菌浓测定
为保证数据的准确度，采用平板法和血球计数板法两种方法测定细菌浓度:
(1)MPN 法[70]:
在西林瓶中准确注入9mL的蒸馏水，灭菌之后备用。聚丙烯酰胺体系中原油的生物降解作用研究，用无菌注射器将1mL 的菌液，注入到注如9mL蒸馏水的西林瓶中，充分摇匀，如此菌液中的细菌浓
51
度就被稀释了 10倍。再从此稀释液中抽取1mL菌液，注入到下一个西林瓶中。 按照这样的步骤，依次逐级稀释，就会得到稀释了 10,、102、103、104…各个稀 释倍数的菌液。用无菌注射器分别取0.1 mL104到107四个稀释度的菌液于富集 培养基的平板上，使用涂布棒均匀涂布。每个浓度梯度涂三个平板作为平行样。 将平板置于35°C的生化培养箱中培养3d之后，对平板上的菌落进行计数。计算 出原始菌液中的菌浓：
总活菌数/mL =符合条件的稀释度3个平板上的菌落平均数X稀释倍数X10
(2)血球计数板法[71]:
血球计数板是一块具有精密刻痕的载玻片，左图中的井字形区域放大后即为 右图结构。计数区域是一个边长为1mm的大方格，在计数室上方平放盖玻片后， 载玻片距离盖玻片0.1mm，因此可以计算出计数室的容液容积为0.1mL。在25 X 16型的计数板中，中央计数区域的大方格由25个中方格构成，每都一个中方 格由16个小方格构成。当菌液充满计数室时，一般选取五个中格，数得总菌数 之后，求得中方格中菌数的平均值。用此平均值乘以25，即计算出了 25个中格 总的细菌数目，之后再计算出1mL菌液中的总菌数。
ll!lilllilllllllll]|
_ , ■ : : i , ^^1
图4-1血球计数板构造 Fig. 4-1 The structure of blood counting chamber
本次实验中使用的计数板规格为25X16。由于原始菌液中菌浓很高，直接
52
计数无法数清菌体数，采用逐级稀释法对菌液进行稀释。计数完毕后。依下列公 式计算菌浓：
细菌个数/1mL=5个中方格菌体总数/80 X 400 X 400 X 10000 X稀释倍数
4.3.2.3.表面张力的测定
每次取样后，对原油进行萃取后，水溶液中含油量很低，经滤纸过滤吸附过 程能保证液面没有油花，对仪器测定不会产生干扰。经处理过的溶液，取约30mL 密封保存于4°C的冰箱中。为保证仪器测定的准确性，实验最后统一测定溶液的 表面张力。采用吊环法和吊片法两种方法测定表面张力。
4.3.2.4.HPAM浓度的测定
取5mL处理后的溶液密封保存于4C的冰箱中，实验最后用淀粉碘化镉法 统一测定溶液中HPAM的浓度。
4.3.2.5溶液粘度测定
取10ml处理后的溶液密封保存于4°C的冰箱中，用乌氏粘度计(0.5-0.6mm)， 在30C条件下测定溶液的相对粘度。
4.3.2.6原油烃组分分析[72]
(1)实验过程中，每天采出的水样，经正己烷萃取后，将原油的正己烷溶液转 入干燥的小烧杯中，加入适量的无水硫酸钠，去除含有的水分。然后再将溶液转 入已经称重的洁净的小烧杯中，将烧杯放在通风厨中挥发正己烷，待挥发完毕后 称重，计算原油质量。
(2)将称重的原油样品，完全溶解到色谱纯正己烷中，定容到25mL。然后经 过柱层析分离得到脂肪烃组分和芳烃组分氮吹浓缩至进样合适体积，加入内标。
(3)样品分析条件：
组分正构烷烃芳烃
方法GC-FIDGC-MS
色谱柱30 m^0.32 mm^0.25 ^m30 m^0.32 mm^0.25 ^m
DB-5毛细管色谱柱DB-5 毛细管色谱柱
载气氦气，2.5 mL/min氦气，1.0 mL/min
分析不分流进样；进样时间：1 mm。进不分流进样；进样口温度：290 C;
条件样口温度：290 C;检测器温度：300检测器温度：300 C;程序升温：90
53
°C;程序升温：50 °C保持2 min，以°C保持1 min，以25 °C/min升到160 6 °C/min 的速度升到 300 °C，300 °C °C，以 8 °C/min 升到 290 °C，保持
保持16 min;进样量：1卩L。15 min。
定性利用保留时间与标准比对判断组分保留时间与特征离子结合进行定性
分析峰位置，结合原油正构烷烃分布规分析
律进行判断
(4)原油烃组分的定量分析
采用内标法定量法计算各组分浓度，其中正构烷烃内标为C24D50,多环芳烃 内标为 Terphenyl-D14。
内标定量计算公式如下，计算得到c (pg/g):
RRF = AC0 'Wl0
A10 WC0 c = AC11
An.RRF.Ws
式中:
AC 0——标准中组分峰面积；
A10——标准中内标峰面积；
WC0标准中组分量；
Wj 0标准中添加内标量；
AC1 —样品中组分峰面积；
An——样品中内标峰面积；
Wn样品中内标量；
Ws——样品质量；
c——样品中组分浓度（昭/g)。
54
4.4结果与讨论 4.4.1发酵过程监测
每次采样时，将搅拌转速调到300rmin-1，将发酵液搅拌均匀，然后采样到
灭过菌的洁净锥形瓶中。每天的发酵液照片如下：
Id2d3d4d5d6d7d
•I感壘籲■靨麗憂
图4-2 1-7d发酵液照片
Fig.4-2 Fermentation photos through 7 days
发酵液表层底层
图4-3最终的发酵液照片 Fig.4-3 Fermentation photos
发酵罐中原油与培养基一起灭菌，冷却之后，原油大多浮在液面或者粘附到 罐壁和搅拌叶轮上。发酵开始后，如图4-3中第一幅图，原油少量进入水体，发 酵进行24h之后原油开始均匀的混入水体，之后液面上基本没有大块浮油，形成 均匀的油水混合状态。在发酵结束之后，将发酵液保存于烧杯中静置24h后，大 量原油沉降到瓶底，发酵液上层变得较为清澈，液面只有很少的浮油存在。
4. 4.2细菌生长曲线
在接种5小时开始采样，48小时之内采样6次，之后每天采样一次。涂布 梯度为10-5，10-6，10-7。血球计数板法计数梯度为10-1，10-2。计算出每1mL发 酵菌液中的细菌数，对菌数取对数值，得到如图4-4的结果。
55
6
024487296120144168
Time/h
6
0
24487296120144168
Time/h
图4-4细菌生长曲线 Fig.4-4 Bacteria growth curve
2d4d6d7d
图4-5发酵过程菌落照片（10-7)
Fig.4-5 Colonies photos (10-7)
发酵初期，细菌快速生长，在24h时达到最大，细菌总浓度在109/mL以上, 之后菌浓开始下降，但仍在168h内保持在108/mL。在富集培养基中W-1细菌优
势生长，但在含有选择性培养基中，W-2是发酵过程的优势菌株，W-1菌浓一直 低于W-2 —个数量级。Y-1细菌在24h内繁殖较快，之后与W-1都处在107/mL
的浓度。 图4-5右图显示，通过CFU法和血球计数板法测得菌浓及其趋势基本相符。 4.4.3表面张力变化
发酵过程中，采得水样，由于含有原油，对测定影响较大。经过萃取和过滤 后，原油基本被去除完全。实验过程中为保证测定的准确性，同时使用吊环法和 吊片法对溶液的表面行里进行测定。将溶液保存后统一测定，会保证仪器测定的 相对稳定性。通过两种方法测得结果如下图：
56
吊片法
55-
50-
45-
吊环法
40
024487296120 144 168
Time/h
图4-6发酵液表面张力变化 Fig.4-6 Surface tension of bacterial broth
图中-24h处显示的数值为表面张力仪测定的室温下蒸馏水的表面张力值。两 种方法测定的表面张力值变化趋势基本一致，在发酵初期（0-9h)表面张力有小 幅降低，随后保持稳定到24h，在24-36h间又有小幅降低，而在后续的发酵过程 中表面张力较为稳定并有略微降低。总体来说，在发酵过程中，溶液的表面张力 在持续降低并趋于稳定，降低幅度不是很大。细菌产生的代谢产物可能是表面张 力降低的原因，而HPAM的存在会一定限度的维持溶液表面张力的稳定。
4. 4.4溶液粘度及HPAM浓度变化
Time/d
2.0
-2
▲
3.5-
3.0-
2.5-
-V 0 ' 1 ' 2 ' 3 ' 4 ' 5 ' 6 ' 7
Time/d
8
实验过程中，测定了溶液的粘度变化及HPAM的浓度变化。测得结果如下:
图4-7溶液相对粘度及HPAM浓度变化 Fig. 4-7 The relative viscosity and HPAM concentration of bacterial broth
57
通过上面两幅图可以发现，在通过高压灭菌后，溶液的相对粘度大幅降低， 由于发酵罐在位灭菌时间很长，相对于灭菌锅灭菌，其粘度降低更多。在发酵过 程中，溶液的粘度略有降低，可能是由于叶轮搅拌的机械剪切作用所致；另外可 以发现HPAM浓度呈下降趋势，但只由500mg-L-1降到440mg-L-1，降低值也很
有限。
4. 4.5发酵曲线
在实验过程中发酵罐监测的数据包括：发酵时间t/h,发酵温度T/°C，发酵 液pH、，溶解氧DO/%,搅拌转速ZS/rpm，通过对发酵时间作图得到如下结果：
图4-8发酵曲线 Fig.4-8 Fermento graph
发酵罐采用内部温度探头和外部冷却循环水双控控温系统，温度维持在 35C。在0-48h，搅拌转速为100r.min-148-168h为200rmin-1。溶解氧由曝气和转
速控制，在0-24h内，溶解氧到达饱和后逐渐降低。自48h调整转速为200rpm 后，溶解氧呈逐渐上升趋势，在120h达到饱和。
58
Hd
△
6.6
024487296120144168
Time/h
nLLo6〇_l
8
图4-9发酵液菌浓与pH值变化 Fig.4-9 The bacterial concentration and pH of bacterial broth 上图是pH的变化趋势，初始pH为6.68,在0-30h期间，pH逐渐降低，30-168h
则逐渐升高，pH在6.6-7.3之间。可以看出pH的变化趋势与菌浓的变化趋势是 相反的，在初期细菌大量繁殖，可能产生酸性代谢产物使pH降低，而随着继续 代谢，酸性物质开始逐渐减少，pH上升。在生理生化鉴定甲基红实验中，W-1 呈阳性，而W-2, Y-1都呈阴性，而W-2菌在发酵过程中是优势菌，所以发酵液 pH总体趋势升高也是合理的。
4. 4.6细菌降解原油组分分析
发酵开始之前，和连续7天采集水样得到的原油样品质量为：
时间/d0(空白） 1234567
质量/g0.35150.57360.41810.63390.47820.39300.53780.6590
4.4.6.1正构烷烃
5000500050
9
5
…uv〇iio,ooo)
uoUBPlmqy
n
.1
/m
me
-【11
s
cuolmXJ目 q<
SUBPUnqy
:
,,uV(3100.000)
图4-10正构烷烃GC-FID色谱图 Fig.4-10 The GC-FID chromatograms of nalkanes
61
30000¬25000¬320000¬) • 15000¬:
：10000- 1 5000-
0
空白
7d
卓 nil
图4-11正构烷烃组分浓度变化 Fig.4-11 Component concentration of nalkanes
62
图4-12原油各组分降解率（7天）
Fig.4-12 Biodegradation rate of nalkanes
图4-10是测得的原油正构烷烃GC-FID色谱图，聚丙烯酰胺体系中原油的生物降解作用研究，通过内标法转换计算之后 得到图4-11的正构烷烃的组分浓度图。
从图4-11可以看出，在实验过程使用的三株细菌，对部分烷烃具有很好的 降解效果。通过比较图4-11中第一天和第三天的组分变化图可以发现，在发酵 初期（0-2d)，虽然细菌大量生长，但原油基本没有发生降解。可能是因为细菌 在初期优先吸收培养基的酵母粉作为碳源。将第6天和第7天的原油组分与空白 惊醒比照，可以看出经细菌发酵处理之后，原油组分总丰度显著降低。
根据原油组分变化，换算出了 7天内的原油降解率如图4-12所示。细菌对 大部分正构烷烃的降解率达到60°%以上，正构烷烃中丰度较小的C13-C16以及 C36-C38均被最大限度的降解，头尾的C13和C38的降解率均达到99°%。在初始点 取的空白原油样中，C28-C32是原油组分中丰度最大的几个组分，占到正构烷烃 总量的61%,除了 C30烷之外，细菌对其它4种组分的降解率约为80%。实验中， 细菌对部分烷烃降解率很低或者没有发生降解：C35、C32、C30、C27、C26、C24 和 C23。
4.4.6.2芳烃组分
63
8§punqv
d
IX
Time/min
4100.000.)
10.
3o§T3uncly
7d
''l(i.O ' ' 1^.0 ' ' 2(i.O ' ' y.d ' ' y.fli ' ' 3I0 ' ' 4^.0 ' 4^.0 ' ' 5(J.O ' ' 5^.0 ' 6(J6 ' ' 6^.0 '''
Time/min
图4-13芳烃GC-MS色谱图 Fig.4-13 GC-MS chromatograms of aromatic hydrocarbons
65
1
2
3
4
5
6
7
3 9
Naphthalene 1 -Methyl-naphthalene 1 -Ethyl-naphthalene 1,6-Dimethyl-naphthalene Ethyl-methyl-naphthalene
1.3.7-Trimethyl-naphthalene
1.3.6.7-T etramethyl -naphthalene Dibenzothiophene
Fluorene
101 -Methyl-fluorene
11Methyl-fluorene
12C2-fluorene
13Phenanthrene
142-Methyl-phenanthrene
15Ethyl-phenanthrene
169-Ethyl-phenanthrene
171,9-Dimethyl-phenanthrene
18C3 -Phenanthrene
图4-14芳烃组分浓度
19Trimethyl-phenanthrene
20C4-Phenanthrene
214-Methyl-dibenzothiophene
22Ethyl-dibenzothiophene
23Dimethyl-dibenzothiophene
24Trimethyl-dibenzothiophene
25Chrysene
263-Methyl-chrysene
27C2-Chrysene
Fig.4-14 Component concentration of aromatic hydrocarbons 图4-13是芳烃组分的GC-MS色谱图，通过计算绘制出芳烃组分的浓度，如 图4-14所示。
所筛选的到的三株细菌对芳烃的降解模式类似于烷烃，在发酵初期0-3天内， 甚至到发酵第5天，细菌仍不能有效地利用芳烃使之发生降解，但在发酵后期对 部分芳烃组分降解效果显著，除了4取代萘，萘的同系物均被完全降解（不排除 发酵过程中组分的自然挥发损失）。随着芳烃环数的增多，降解难度增大，三甲
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基二苯并噻吩（Trimethyl-dibenzothiophene)以及Chrysene及其同系物几乎没有
发生降解，组分浓度在7天的发酵过程中一直保持稳定。
经过计算烷烃的总降解率约为70%，芳烃的总降解率约为80%。此降解率明 显高于在使用摇瓶培养过程中，用紫外分光光度法测的原油降解率39%。一方面 由于方法存在差异，另外发酵过程中，控制的环境条件更利于细菌的生长，大大 提高了对原油的降解效果。
4. 5本章小结
本章系统的考察了聚丙烯酰胺环境中细菌对原油的降解作用。主要获得以下 结论：
(1)发酵过程初期，细菌增长迅速，在30h内增长到最大菌浓，之后菌浓维 持稳定并缓慢降低。随着细菌的生长，发酵液表面张力逐渐降低，原油乳化明显。 而pH值得变化趋势与菌浓变化趋势相反。
(2)经灭菌过程，溶液粘度大幅降低，在之后的连续发酵过程中，发酵液的 相对粘度保持稳定并有小幅下降。聚丙烯酰胺的浓度略微减小由500mg_L-1降低 到440mg.L-1。聚丙烯酰胺的存在对原油乳化絮凝效果良好，发酵结束后，将发 酵液静置，大部分原油发生絮凝沉降。
(3)三株细菌混合发酵，对原油具有显著的降解效果，聚丙烯酰胺体系中原油的生物降解作用研究，部分烷烃芳烃被完全 降解。对正构烷烃总降解率为70%，对芳烃总降解率为80%。
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5结论
5.1结论
本论文主要以聚合物驱含油污水作为研究对象，初步探索了聚丙烯酰胺存在 的环境中细菌对于原油的降解作用。实验过程中考察了 HPAM浓度的测定方法， HPAM溶液中原油的回收率并从含油污水中筛选了对原油具有一定降解效果的 菌株，利用发酵罐模拟了含聚污水中细菌对于原油的降解行为。实验所得主要结 论如下：
(1)实验过程中使用的阴离子聚丙烯酰胺其相对分子量为M=9.184x106; 在淀粉碘化镉法、浊度法、粘度法和导数紫外法四种测定聚丙烯酰胺浓度的方法 中，淀粉碘化镉法较适用于污水中HPAM浓度的测定。
(2)聚丙烯酰胺的相对粘度随浓度增加呈指数增长，无机盐增加、灭菌、 机械剪切会使聚丙烯酰胺的相对粘度降低，pH值的增高或降低也会使聚丙烯酰 胺的相对粘度降低。聚丙烯酰胺与原油形成的乳液中，利用石油醚对原油进行萃 取回收，溶液相对粘度越大，原油回收率越低。
(3)从胜利油田污水中筛选得到三株对原油具有降解效果的细菌：W-1， W-2，Y-1。通过比较，三株细菌混合对原油具有较好的降解效果，通过对营养 元素的选择，及环境条件的优化。培养基配方为：Naa3g.L-1，MgS〇4.7H2〇 0.7g-L-1，KH2PO4 3.0g-L-1，Na2HP〇4 1.5g-L-1，CaCb 0.1g.L-1，酵母粉 1g-L-1，pH 7。培养条件为：温度35 °C，pH=7。培养5天混合菌株对原油的降解率为31.4%， 菌株对原油具有一定的絮凝能力，能将使大部分原油沉降。
(4)在培养基中添加聚丙烯酰胺后，在初期溶液中菌浓与不添加聚丙烯酰 胺基本一致，随后增加，在第6天时比不添加HPAM高出一个数量级；而随着 HPAM浓度的增加，细菌对原油的降解率略有增加。HPAM的存在对细菌生长具 有促进作用。
(5)在聚丙烯酰胺环境中，经发酵罐控制发酵，三株细菌对原油具有良好 的降解效果。细菌对原油组分中的大部分烷烃和芳烃都具有明显降解效果，对烷 烃总体降解率为70%,对芳烃总体降解率为80%。聚丙烯酰胺的存在，原油发
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酵时乳化明显，发酵结束后体系中原油发生了絮凝沉降。
5.2存在的问题及展望
由于受到实验条件和实验时间的限制，实验存在不足，具体如下：
(1)论文对HPAM与原油的相互作用探索十分浅显，聚丙烯酰胺体系中原油的生物降解作用研究，没有对原油与聚丙烯 酰胺溶液的乳化与破乳机理进行研究。
(2)没有对筛选的菌种进行鉴定分析，三株细菌对原油的降解效果并不太高。 细菌对于原油具有絮凝效果，欠缺对絮凝原因进行深入探索。
(3)HPAM对细菌生长影响及对降解原油的影响探索不够。
(4)由于发酵罐运行限制，没有对聚合物环境中细菌对原油的降解作用进行 长期考查，溶液中聚丙烯酰胺的变化欠缺研究。
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